טרנסדוקציה של עוברים מופריים של חולדה מבוססת וקטור לנטי-ויראלי

תקציר

מקור: קוזה, פ., ואח׳ יצירת חולדות טרנסגניות באמצעות גישת וקטור לנטי-ויראלי. J. Vis. Exp. (2020)

סרטון זה מדגים החדרה של וקטורים לנטיביריאליים לעוברים מופריים של חולדה באמצעות מיקרו-הזרקה, על מנת להשיג אינטגרציה יציבה של טרנסגן ליצירת חולדות טרנסגניות.

פרוטוקול

כל ההליכים הכוללים דגימות מבעלי חיים נסקרו ואושרו על ידי ועדת האתיקה הרלוונטית לניסויים בבעלי חיים.

1. מיקרו-הזרקה של וקטורים לנטיוויראליים לעובר בשלב תא אחד מתחת ל-zona pellucida
   הערה: יש להשתמש בעוברים בשלב תא אחד עם שני גרעיני קדם (pronuclei) נראים לצורך המיקרו-הזרקה (איור 1).
   1. הפשיר את המנה (aliquot) של הלנטיווירוס (LV) בטמפרטורת החדר וסבב בצנטריפוגה ב-10,000 x g ובטמפרטורת החדר (RT) למשך 2 min כדי לשקיע שאריות תאיות שנותרו.
   2. הגדרת המיקרו-הזרקה
      1. הכן פיפטות החזקה מזכוכית (קפילרה מזכוכית בורוסיליקט) באמצעות microforge. משוך את קפילרת הזכוכית מעל להבה כדי ליצור קצה באורך 5–10 cm. שבור את הפיפטה כך שיישאר קצה של ~4 cm. הקוטר החיצוני צריך להיות ~80–120 µm.
         הערה: ודא שקצה הפיפטה ישר וחלק לחלוטין.
      2. הרכב את הפיפטה שנמשכה ב-microforge כאשר הקצה נמצא לפני פילמנט החימום. חמם את הפילמנט קרוב מאוד לקצה הפיפטה ואפשר לו להתכווץ לקוטר של ~15 µm (כ-20% מגודל העובר). מקם את הפיפטה בניצב לפילמנט החימום, במרחק של 2–3 mm מקצה הפיפטה, והתחל לחמם. הזכוכית תתרכך. חמם עד להגעה לזווית של 15°.
      3. הכן קפילרות זכוכית בורוסיליקט למיקרו-הזרקה עם פילמנט באמצעות שובר פיפטות (pipette puller). הכנס את הקפילרה לתא המתיחה. בצע בדיקת ramp (בפעם הראשונה עבור זכוכית חדשה ובכל פעם לאחר החלפת הפילמנט). הגדר את ה-Heat לערך ה-ramp פחות 10, את ה-Pull ל-100, את ה-Velocity ל-150 ואת ה-Time ל-100.
         הערה: שנה את הפרמטרים כדי לקבל קפילרה הזרקה אופטימלית.
      4. תחת מנדף זרימה למינרית לבטיחות ביולוגית, טען כ-2 µL של התמיסה הוויראלית לתוך פיפטת המיקרו-הזרקה באמצעות קצה של microloader.
      5. הכן צלחת מיקרו-הזרקה (מכסה של צלחת פטרי 60 mm) עם טיפה של 100 µL של מצע M2 (במרכז), מכוסה בפרפין נוזלי או בשמן מינרלי.
      6. חבר את פיפטת ההחזקה ואת קפילרת המיקרו-הזרקה הטעונה בתמיסה הוויראלית למיקרו-מניפולטור ולצלחת המיקרו-הזרקה תחת מיקרוסקופ הפוך.
   3. ביצוע המיקרו-הזרקה
      1. העבר 15–20 עוברים בשלב תא אחד לטיפת ה-M2 שעל צלחת המיקרו-הזרקה. החזק את העובר באמצעות פיפטת החזקה.
      2. באמצעות הגדלה של 400x, הזרק את תמיסת ה-LV מתחת ל-zona pellucida אל החלל הפריביטליני (perivitelline space) באמצעות קפילרת הזכוכית המחוברת למזרק אוטומטי. החזק את הקפילרה מתחת ל-zona pellucida לרגע.
         הערה: בשימוש בלחץ חיובי עדין, התמיסה הוויראלית תזרום באופן רציף מקפילרת ההזרקה, אך לא ניתן לשלוט בנפח הסספנזיה המוזרק.
      3. באמצעות פיפטה עדינה, החזר את העוברים לצלחת התרבית באינקובטור ב-37 °C באטמוספירה של 5% CO₂ . מספר ההזרקות לזיגוט אחד עשוי להשתנות וניתן להתאימו בהתאם לריכוז הווקטור הוויראלי.
         הערה: ניתן להעביר את העוברים המוזרקים לאימהות חסות בשלב תא אחד או לדגרו אותם בן לילה (O/N) במצע M16 לפני העברתם בשלב תאين. יש להימנע מתרבית in vitro ממושכת של עוברי חולדה.

תוצאות

איור 1. תצלום מיקרוסקופי של עובר חולדה בשלב תא אחד שהוכן להזרקת וקטור לנטיבירי לסביב החלל התת-זונלי. העובר קובע במקומו באמצעות פיפטת החזקה. נראים שני גרעיני קדמונים (pronuclei) המכילים חומר גנטי אימהי ואבהי, וכן הגוף הקוטבי. סרגל קנה מידה = 20 μm.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
מכלולי צינורות שאיבה לפיפטות מיקרו-קפילריות מכויילות	Sigma	A5177-5EA
קפילריות זכוכית בורוסיליקט עם פילמנט GC100TF-15	Harvard Apparatus Limited	30-0039	קפילרית הזרקה
צלחת תרבית לרקמה ותאי CELLSTAR 35-mm	Greiner Bio-One	627160
צלחת תרבית לרקמה ותאי CELLSTAR 60-mm	Greiner Bio-One	628160
שמן מינרליים	Sigma	M8410-500ML
מיקרוסקופ הפוך	Zeiss	Axiovert 200
מצע M2	Sigma	M7167
VacuTip	Eppendorf	5175108	קפילרית תמיכה
מצע M16 EmbryoMax	Sigma	MR-016-D