טיהור של אינטגראז ויראלי באמצעות כרומטוגרפיית זיקה

תקציר

כרומטוגרפיית זיקה לניקל הפשיר משקע חיידקי אחד על קרח. הערה: פעולה זו תארך זמן משמעותי (בערך 2-3 שעות). כאשר המשקע יופשר לסלרי תאים, הוסף 500 μM נוספים של Phenylmethanesulfonyl Fluoride (PMSF) (תמיסת מקור 100 mM). שמור את מבחנת ה-50 מ"ל של סלרי החיידקים על קרח. בצע סוניקציה לחיידקים בעוצמה של 30% למשך 30 שניות (שנייה אחת פעילה, שנייה אחת כבויה) עבור כל משקע שהופק מ-1 ליטר תרבית, באמצעות סוניקטור עם קרן ביולוגית בקוטר 0.5 אינץ' ומיקרו-טיפ קוני בקוטר 0.125 אינץ', בתדר של 20 kHz ובהספק מרבי של 400 W. העבר את דגימת התאים למבחנת אולטרה-צנטריפוגה קרה. השתמש במכלים מפוליקרבונט (קוטר 25 מ"מ, גובה 89 מ"מ) התואמים לרוטור בזווית קבועה מסוג Type 60 Ti. ניתן להשתמש במבחנות וברוטורים חלופיים אם מושגת אותה כוח כבידה. סבב ב-120,000 x g למשך 60 דקות ב-4 °C. אמור להיווצר משקע ברור. למשקע העליון עשוי להיות גוון צהוב. העבר את המשקע העליון על ידי מזיגה או פיפטה למבחנה קונוית קרה של 50 מ"ל. רשום את הנפח; נפח זה אמור להיות בערך כנפח באפר השעיית התאים ששימש לפני ההקפאה המהירה. אם המשקע העליון צמיגי, הוא עלול להיות מזוהם ב-DNA חיידקי שעלול לסתום את עמודת הכרומטוגרפיה. במקרה זה, חזור על האולטרה-צנטריפוגציה כדי לשקיע את ה-DNA החיידקי. הכן 500 מ"ל באפר A (50 mM Tris-HCl, pH 7.5, 500 mM NaCl, 500 μM PMSF) ו-500 מ"ל באפר B (50 mM Tris-HCl, pH 7.5, 500 mM NaCl, 500 μM PMSF, 200 mM imidazole). הערה: בפרוטוקול זה, שמור את מערכת הכרומטוגרפיית חלבונים נוזלית מהירה (FPLC), את כל הבאפרים ואת הדגימה ב-4 °C בחדר קר. סנן באופן סטרילי את באפרים A ו-B באמצעות יחידות סינון חד-פעמיות של 0.2 μm. בהתאם למערכת ה-FPLC, שטוף את משאבה A ומשאבה B בבאפר A ובבאפר B, בהתאמה. העבר דרך המערכת 90% באפר A ו-10% באפר B עד שהמוליכות וקריאות העל-סגול (UV) יתייצבו. קצב הזרימה המרבי תלוי במכשיר; השתמש בקצב זרימה של 5 מ"ל/דקה עם הגבלת לחץ מרבית של 1.0 MPa. הכן עמודת FPLC באורך 110 מ"מ ובקוטר 5 מ"מ עם 1.5 מ"ל שרף טעון בניקל (קיבולת קישור מרבית 50 מ"ג/מ"ל, לחץ מרבי 1 MPa). ניתן להכין את העמודה יום לפני הניקוי ולשמור אותה ב-4 ˚C. חבר את העמודה למכשיר ה-FPLC. השגה שיווי משקל בעמודה עם 20 מ"ל של 90% באפר A ו-10% באפר B (20 mM imidazole) בקצב זרימה של 0.5 מ"ל/דקה עם הגבלת לחץ מרבית של 0.5 MPa. המכשיר אמור לאסוף נתונים בזמן אמת של מוליכות ובליעת UV ב-280 ננומטר (A280). קריאות המוליכות וה-UV אמורות להתייצב. אם קריאות אלו לא התייצבו, המשך להזרים באפרים דרך העמודה עד שיהיו יציבות. טען את דגימת החלבון (~10 מ"ל למשקע) לעמודה בקצב זרימה של 0.15 מ"ל/דקה עם הגבלת לחץ מרבית של 0.5 MPa. קצב הזרימה ולחץ העמודה נותרים ללא שינוי לאורך כל תהליך הניקוי. אסוף את נוזל השטיפה (flow through) למבחנה של 50 מ"ל. שטוף את העמודה עם 20 מ"ל של 90% באפר A ו-10% באפר B. אסוף את השטיפה למבחנה של 50 מ"ל. בצע אלוציה של החלבונים באמצעות גרדיאנט ליניארי של 20 מ"ל מ-10% עד 100% באפר B (20 mM עד 200 mM imidazole). לבסוף, שטוף את העמודה עם 5 מ"ל של 100% באפר B (200 mM imidazole). אסוף את הגרדיאנט ואת השטיפה הסופית בפרקציות של 0.27 מ"ל. שלב 15 μL של באפר דגימה 2x SDS-PAGE עם 15 μL של פרקציות נוזל השטיפה, השטיפה והשיא ב-A280. הרתח את הדגימות למשך 3 דקות. הכן שני ג'לים של 10% SDS-PAGE. טען 10 μL מכל דגימה לג'לים ו-4 μL של סטנדרטים של חלבון צבועים מראש. הרץ, צבע ונתח את הג'לים. שלב פרקציות שנראה כי הן מכילות prototype foamy virus integrase (PFV IN) טהור כמעט, בהתבסס על בדיקה חזותית. מדוד את הנפח באמצעות פיפטה, בדרך כלל 8-10 מ"ל. באמצעות ספקטרופוטומטר, מדוד את ה-A280 של הפרקציות המשולבות וחשב את הכמות הכוללת של חלבון PFV IN; התנובה הטיפוסית היא ~10 מ"ג לליטר של תרבית מושרית. מקדם ההכחדה של PFV IN עם תג ההקסה-היסטידין הוא 59360 cm-1 M-1. לופז ג'וניור, מ. א., ואחריםזיהוי והסרה של זיהום נוקלאז במהלך טיהור של פרוטואיטיפ פומי וירוס אינטגראז (Prototype Foamy Virus Integrase) רקומביננטי. J. Vis. Exp. (2017)

סרטון זה מדגים את טיהורה של אינטגראז ויראלי עם תג פוליהיסטידין באמצעות כרומטוגרפיית זיקה לניקל. הפרוטוקול משתמש באלוציה במדרג של אימידזול כדי לבודד באופן סלקטיבי את האינטגראז על סמך זיקתו לשרף טעון בניקל.

פרוטוקול

1. כרומטוגרפיית זיקה לניקל

1. הפשיר משקע חיידקי אחד על קרח.
   הערה: פעולה זו תארך זמן משמעותי (כ-2 עד 3 שעות). כאשר המשקע יופשר למרקם של תגלי של תאים, הוסף 500 μM נוספים של Phenylmethanesulfonyl Fluoride (PMSF) (מתוך תמיסת מלאי 100 mM).
2. שמור את מבחנת ה-50 mL של תגלי החיידקים על קרח. בצע סוניקציה לחיידקים באמפליטודה של 30% למשך 30 s (שנייה אחת פעילה, שנייה אחת במנוחה) לכל משקע שהופק מ-1 L תרבית, באמצעות סוניקטור בעל קרן ביולוגית (bio horn) בקוטר 0.5 inch עם מיקרוטיפ קונוי בקוטר 0.125 inch, בתדר של 20 kHz והספק מקסימלי של 400 W.
3. העבר את דגימת התאים למבחנת אולטרה-צנטריפוגה קרה. השתמש במערכי בקבוקי פוליקרבונט (קוטר 25 mm, גובה 89 mm) התואמים לרוטור זווית קבועה מסוג Type 60 Ti. ניתן להשתמש במבחנות וברוטורים חלופיים אם מושגת אותה כוח כבידה. סבב ב-120,000 x g למשך 60 min ב-4 °C. אמור להיווצר משקע ברור. לנוזל העליון (supernatant) עשוי להיות גוון צהוב.
4. העבר את הנוזל העליון באמצעות מזיגה או פיפטה למבחנה קונית קרה של 50 mL. רשום את הנפח; נפח זה אמור להיות בקירוב לנפח בופר הריסוספנסיון ששימש לפני ההקפאה המהירה (snap freezing). אם הנוזל העליון צמיגי, ייתכן שהוא מזוהם ב-DNA חיידקי שעלול לסתום את עמודת הכרומטוגרפיה. במקרה זה, חזור על האולטרה-צנטריפוגציה כדי להשקיע את ה-DNA החיידקי.
5. הכן 500 mL בופר A (50 mM Tris-HCl, pH 7.5, 500 mM NaCl, 500 μM PMSF) ו-500 mL בופר B (50 mM Tris-HCl, pH 7.5, 500 mM NaCl, 500 μM PMSF, 200 mM imidazole).
   הערה: בפרוטוקול זה, שמור את מערכת הכרומטוגרפיית נוזלים מהירה של חלבונים (FPLC), את כל הבופרים ואת הדגימה ב-4 °C בחדר קר.
   1. סנן בסינון סטרילי את בופרים A ו-B באמצעות יחידות סינון חד-פעמיות של 0.2 μm. בהתאם למערכת ה-FPLC, שטוף את משאבה A ומשאבה B עם בופר A ובופר B, בהתאמה. העבר 90% בופר A ו-10% בופר B דרך המערכת עד שקריאות המוליכות והקריאות באולטרה-סגול (UV) יתייצבו. קצב הזרימה המקסימלי תלוי במכשיר; השתמש בקצב זרימה של 5 mL/min עם הגבלה של לחץ מקסימלי של 1.0 MPa.
6. הכן עמודת FPLC באורך 110 mm ובקוטר 5 mm עם 1.5 mL שרף טעון בניקל (קיבולת קישור מקסימלית 50 mg/mL, לחץ מקסימלי 1 MPa). ניתן להכין את העמודה ביום שלפני הטיהור ולשמור אותה ב-4 ˚C.
7. חבר את העמודה למכשיר ה-FPLC. בצע שיווי משקל (equilibrate) לעמודה עם 20 mL של 90% בופר A ו-10% בופר B (20 mM imidazole) בקצב זרימה של 0.5 mL/min עם הגבלה של לחץ מקסימלי של 0.5 MPa. המכשיר אמור לאסוף נתוני זמן אמת של מוליכות ובליעת UV ב-280 nm (A₂₈₀). קריאות המוליכות וה-UV אמורות להתייצב. אם קריאות אלו לא התייצבו, המשך להזרים בופרים דרך העמודה עד שיהיו יציבות.
8. טען את דגימת החלבון (~10 mL למשקע) לעמודה בקצב זרימה של 0.15 mL/min עם הגבלה של לחץ מקסימלי של 0.5 MPa. קצב הזרימה ולחץ העמודה יישארו ללא שינוי לאורך כל תהליך הטיהור. אסוף את הנוזל שעבר (flow through) למבחנה של 50 mL.
   1. שטוף את העמודה עם 20 mL של 90% בופר A ו-10% בופר B. אסוף את השטיפה למבחנה של 50 mL. בצע אלוציה לחלבונים באמצעות גרדיאנט ליניארי של 20 mL מ-10% עד 100% בופר B (20 mM עד 200 mM imidazole).
   2. לבסוף, שטוף את העמודה עם 5 mL של 100% בופר B (200 mM imidazole). אסוף את הגרדיאנט ואת השטיפה הסופית בפרקציות של 0.27 mL.
9. ערבב 15 μL של בופר דגימה 2x SDS-PAGE עם 15 μL של פרקציות הנוזל שעבר, השטיפה ושיאי ה-A₂₈₀. הרתח את הדגימות למשך 3 min.
   1. הכן שני ג'לים של 10% SDS-PAGE. טען 10 μL מכל דגימה לג'לים ו-4 μL של סטנדרטים של חלבון צבועים מראש. הרץ, צבע ונתח את הג'לים.
   2. אחד פרקציות שנראות כמכילות prototype foamy virus integrase (PFV IN) טהור כמעט, בהתבסס על בדיקה ויזואלית. מדוד את הנפח באמצעות פיפטה, בדרך כלל 8 - 10 mL.
   3. באמצעות ספקטרופוטומטר, מדוד את ה-A₂₈₀ של הפרקציות המאוחדות וחשב את הכמות הכוללת של חלבון PFV IN; התפוקה הטיפית היא ~10 mg לליטר של תרבית מושרית. מקדם האטילה של PFV IN עם תג ההקסאהיסטידין הוא 59360 cm^-1 M^-1.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
BL21/DE3 Rosetta E. coli	EMD Millipore	70956-4
Imidazole	Sigma-Aldrich	I0250
Ni-NTA Superflow	Qiagen	30430