טיהור של אינטגראז ויראלי באמצעות כרומטוגרפיית זיקה להפרין

תקציר

כרומטוגרפיית זיקה להפרין. הכין 250 מ"ל של Buffer C (50 mM tris(hydroxymethyl)aminomethane hydrochloride (Tris-HCl), pH 7.5, 10 mM dithiothreitol (DTT), 0.1 mM ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA), 500 μM phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF)) ו-250 מ"ל של Buffer D (50 mM Tris-HCl, pH 7.5, 10 mM DTT, 0.1 mM EDTA, 500 μM PMSF, 1 M NaCl). הערה: בפרוטוקול זה, מערכת הכרומטוגרפיית נוזלים מהירה של חלבונים (FPLC), הבאפרים והדגימה נשמרים בחדר קירור בטמפרטורה של 4 ˚C. סנן באופן סטרילי את Buffers C ו-D באמצעות יחידות סינון חד-פעמיות של 0.2 μm. בהתאם למערכת ה-FPLC, שטוף את משאבה A ומשאבה B עם Buffer C ו-Buffer D, בהתאמה. העבר דרך המערכת תערובת של 80% Buffer C ו-20% Buffer D עד להתייצבות קריאות המוליכות והבליעה באולטרה-סגול (UV). קצב הזרימה המקסימלי תלוי במכשיר; באופן שגרתי אנו משתמשים בקצב זרימה של 5 מ"ל/דקה עם הגבלת לחץ מקסימלית של 1.0 MPa. הכין עמודת FPLC באורך 80 מ"מ ובקוטר 5 מ"מ עם 1 מ"ל של שרף heparin Sepharose (קיבולת קישור מקסימלית של 2.0 מ"ג של bovine antithrombin III למ"ל שרף; לחץ מקסימלי 1.4 MPa). ניתן להכין את העמודה ביום שלפני הטיהור ולאחסנה ב-4 °C. חבר את העמודה למכשיר ה-FPLC. השג את שיווי המשקל של העמודה עם 20 מ"ל של 80% Buffer C ו-20% Buffer D (200 mM NaCl) בקצב זרימה של 0.5 מ"ל/דקה עם הגבלת לחץ מקסימלית של 1 MPa. המכשיר צריך לאסוף נתונים בזמן אמת על מוליכות ובליעת UV ב-280 ננומטר (A280). קריאות המוליכות וה-UV צריכות להתייצב. אם קריאות אלו לא התייצבו, המשך להזרים באפרים דרך העמודה עד שיהיו יציבים. הפחת את ריכוז ה-NaCl של דגימת ה-prototype foamy virus integrase (PFV IN) ל-200 mM על ידי הוספת 1.5 נפחים של Buffer C. לדוגמה, הוסף 15 מ"ל של Buffer C ל-10 מ"ל PFV IN. הנפח הכולל שלנו הוא בדרך כלל כ-25 מ"ל. טען את דגימת ה-PFV IN המדוללת על עמודת ה-heparin Sepharose בקצב זרימה של 0.5 מ"ל/דקה עם הגבלת לחץ מקסימלית של 1.0 MPa. קצב הזרימה ולחץ העמודה נשארים ללא שינוי לאורך כל תהליך הטיהור. אסוף את השבירה (flow-through) למבחנה קונית של 50 מ"ל. שטוף את העמודה עם 20 מ"ל של 80% Buffer C ו-20% Buffer D (200 mM NaCl), ואסוף את השטיפה למבחנה קונית של 50 מ"ל. בצע אלוציה מהעמודה באמצעות גרדיאנט ליניארי של 30 מ"ל מ-20% עד 100% Buffer D (200 mM עד 1 M NaCl). שטוף את העמודה עם 5 מ"ל של 100% Buffer D. אסוף את הגרדיאנט ואת השטיפה הסופית בפרקציות של 0.37 מ"ל. נתח את הטעינה, השבירה, השטיפה והפרקציות באמצעות אלקטרופורזה של ג'ל פוליאקרילמיד ונתרן דודציל סולפט (SDS-PAGE) בריכוז 8%. ל-PFV IN, לאחר ניתוק תג ההקסה-היסטידין, יש משקל מולקולרי של 44,394 Da, ומקדם האבסיביות נשאר 59,360 cm-1 M-1 ללא תג ההקסה-היסטידין. אחסן את כל הפרקציות ב-4 ˚C עד להשלמת בדיקת נוקלאז. .Lopez Jr., M ואחריםזיהוי והסרה של זיהום בנוקליאז במהלך טיהור של אינטגראז רקומביננטי מהוירס קצפי פרוטוטיפי (Prototype Foamy Virus Integrase). J. Vis. Exp. (2017)

סרטון זה מדגים את הפרוצדורה לניקוי אינטגראזה ויראלית מזיהום של נוקלאזה בקטריאלית באמצעות כרומטוגרפיית עמודה של heparin Sepharose, ולאחריה אנליזת SDS-PAGE לאישור טוהר החלבון.

פרוטוקול

1. כרומטוגרפיית זיקה להפרין
   1. הכינו 250 mL של Buffer C (50 mM tris(hydroxymethyl)aminomethane hydrochloride (Tris-HCl), pH 7.5, 10 mM dithiothreitol (DTT), 0.1 mM ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA), 500 μM phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF)) ו-250 mL של Buffer D (50 mM Tris-HCl, pH 7.5, 10 mM DTT, 0.1 mM EDTA, 500 μM PMSF, 1 M NaCl).
      הערה: בפרוטוקול זה, מערכת הכרומטוגרפיה הנוזלית המהירה של חלבונים (FPLC), הבאפרים והדגימה נשמרים בחדר קירור בטמפרטורה של 4 ˚C.
      1. סננו את Buffers C ו-D באמצעות יחידות סינון חד-פעמיות של 0.2 μm. בהתאם למערכת ה-FPLC, שטפו את משאבה A ומשאבה B עם Buffer C ו-Buffer D, בהתאמה. העבירו 80% Buffer C ו-20% Buffer D דרך המערכת עד שקריאות המוליכות והקרינה העל-סגולה (UV) יתייצבו. קצב הזרימה המקסימלי תלוי במכשיר; אנו משתמשים באופן שגרתי בקצב זרימה של 5 mL/min עם הגבלת לחץ מקסימלית של 1.0 MPa.
   2. הכינו עמודת FPLC באורך 80 mm ובקוטר 5 mm עם 1 mL של שרף heparin Sepharose (קיבולת קשירה מקסימלית של 2.0 mg של bovine antithrombin III לכל mL שרף; לחץ מקסימלי 1.4 MPa). ניתן להכין את העמודה ביום שלפני הטיהור ולשמור אותה בטמפרטורה של 4 °C. חברו את העמודה למכשיר ה-FPLC.
      1. השילו את העמודה באמצעות 20 mL של 80% Buffer C ו-20% Buffer D (200 mM NaCl) בקצב זרימה של 0.5 mL/min עם הגבלת לחץ מקסימלית של 1 MPa. המכשיר צריך לאסוף נתונים בזמן אמת על מוליכות ובליעת UV באורך גל של 280 nm (A₂₈₀). קריאות המוליכות וה-UV צריכות להתייצב. אם קריאות אלו לא התייצבו, המשיכו להעביר באפרים דרך העמודה עד שיתייצבו.
   3. הפחיתו את ריכוז ה-NaCl של דגימת ה-prototype foamy virus integrase (PFV IN) ל-200 mM על ידי הוספת 1.5 נפחים של Buffer C. לדוגמה, הוסיפו 15 mL של Buffer C ל-10 mL של PFV IN. הנפח הכולל שלנו הוא בדרך כלל ~25 mL.
   4. העמיסו את דגימת ה-PFV IN המדוללת על עמודת ה-heparin Sepharose בקצב זרימה של 0.5 mL/min עם הגבלת לחץ מקסימלית של 1.0 MPa. קצב הזרימה ולחץ העמודה יישארו ללא שינוי לאורך כל תהליך הטיהור. אספו את השברים (flow-through) למבחנה קונוית של 50 mL.
      1. שטפו את העמודה עם 20 mL של 80% Buffer C ו-20% Buffer D (200 mM NaCl), ואספו את השטיפה למבחנה קונוית של 50 mL. בצעו אלוציה מהעמודה באמצעות גרדיאנט ליניארי של 30 mL מ-20% עד 100% Buffer D (200 mM עד 1 M NaCl).
      2. שטפו את העמודה עם 5 mL של 100% Buffer D. אספו את הגרדיאנט ואת השטיפה הסופית בפרקציות של 0.37 mL.
   5. נתחו את החומר המועמס, השברים, השטיפה והפרקציות באמצעות אלקטרופורזה של ג'ל פוליאקרילאמיד וסודיום דודציל סולפט (SDS-PAGE) בריכוז 8%. ל-PFV IN, לאחר ניתוק תג ה-hexahistidine, יש משקל מולקולרי של 44,394 Da, ומקדם האטישה נשאר 59,360 cm^-1 M^-1 ללא תג ה-hexahistidine. שמרו את כל הפרקציות בטמפרטורה של 4 ˚C עד להשלמת בדיקת נוקלאז.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
IPTG (Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside)	Denville Scientific	CI8280
Tris Ultra Pure	Gojira Fine Chemicals	UTS1003
NaCl	P212121	RP-S23020
PMSF (Phenylmethanesulfonyl fluoride)	Amresco	754
DTT (Dithiothreitol)	P212121	SV-DTT
UltraPure EDTA	Invitrogen/Gibco	15575
Heparin Sepharose 6 Fast Flow	GE Healthcare Life Sciences	17-0998-01