כימות חלקיקי פסאודו-וירוס באמצעות בדיקת פלאקים (Plaque Assay)

תקציר

קביעת תיתור של פסאודו-וירוס של נגיף הסטומטיט הוסיקולרי המבטא את חלבון הספייק של נגיף הקורונה וחלבון פלואורסצנטי ירוק משופר (VSV-S-eGFP). 1. דילול סדרתי לקביעת תיתור נגיפי 1. זרע תאי Vero E6 בלוחות בעלי 6 בארות בצפיפות זריעה של 6 × 10⁵ תאים לבארה בתוך מצע Dulbecco's Modified Eagle Medium או DMEM (עם 10% FBS (סרום בקר עוברי)), והדגר אותם למשך לילה בטמפרטורה של 37 °C עם 5% CO₂. הערה: ניתן להשתמש גם בתאי Vero המבטאים באופן יתר את TMPRSS2 ו-hACE2. 2. הכן סדרת דילולים עשריים של נגיף ה-VSV-SeGFP ב-DMEM קר ללא סרום, על ידי הוספת 900 μL של מצע לשבעה מבחנות מיקרו-צנטריפוגה. סמן את המבחנות במספרים 1 עד 7. הוסף 100 μL מהמלאי הנגיפי למבחנה הראשונה ובצע ערבוב קצר ב-vortex. העבר 100 μL מהנגיף המדולל ממבחנה 1 למבחנה 2 ובצע ערבוב קצר ב-vortex; המשך כך עד למבחנה 7. 3. שאב את המצע מכל הבארות בלוח 6-הבארות המכיל תאי Vero E6, והחלף אותו ב-500 μL מדילולים 10⁵ עד 10⁷. הדגר את הלוחות במשך 45 דקות ב-37 °C עם 5% CO₂, תוך ניעור עדין כל 15 דקות. 4. שאב את האינוקולום והחלף אותו בשכבת כיסוי המכילה תערובת של 1:1 של 2x DMEM ו-6% קרבוקסימתיל צלולוז (CMC), בריכוז סופי של 3% CMC, בתוספת 10% FBS; הדגר ב-34 °C עם 5% CO₂ למשך 48 שעות. הערה: חמם מראש את תערובת הכיסוי באמבט מים בטמפרטורה של 37 °C למשך 15 דקות במהלך שלב ההדבקה. ניתן להשתמש בתערובת של 1:1 של 1% אגרוז עם 2x DMEM בתוספת 10% FBS במקום CMC. כדי ליצור כיסוי עם אגרוז, הרתח 1% אגרוז (ב-dH₂O) וערבב עם 2x DMEM קר. ודא שהתערובת נמצאת בטמפרטורה מתאימה לפני הוספתה לשכבת התאים (בערך 37-40 °C). אם נעשה שימוש באגרוז לשכבת הכיסוי, יש לקבע את התאים על ידי הדגרה ב-2 מ"ל של תערובת מתנול:חומצה אצטית ביחס של 3:1 למשך שעה אחת לפחות לפני הצביעה. 2. צביעה וחישוב תיתור נגיפי 1. זהה פלאקים באמצעות צביעה ב-crystal violet או באמצעות תצפית ישירה על eGFP תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי. 2. לצביעת הלוחות, שאב את שכבת הכיסוי, שטוף פעם אחת עם PBS, ולאחר מכן הוסף 2 מ"ל של 0.1% crystal violet (ב-80% מתנול ו-dH₂O) לכל בארה. הנח את הלוחות על נער (plate rocker) למשך כ-20 דקות בטמפרטורת החדר לפני הסרת הצבע. הסר את ה-crystal violet, ושטוף בעדינות כל בארה פעמיים באמצעות dH₂O או PBS. הערה: יש לבצע את שלבי השטיפה והצביעה בעדינות על ידי פיפטור איטי לכיוון דופן כל בארה, כדי להבטיח ששכבת התאים תישאר שלמה לאורך הפרוצדורה. 3. השאר את הלוחות לייבש למשך שעה אחת לפחות לפני ספירת הפלאקים. ודא שספירת הפלאקים מתבצעת בבארות המכילות בין 20 ל-200 פלאקים. כדי לחשב את תיתור הנגיף ביחידות יוצרי פלאק (PFU) למ"ל, הכפל את מקדם הדילול של הבארה שנספרה בנפח ההדבקה, וחלק מספר זה במספר הפלאקים שנמצאו בבארה הרלוונטית. ג'מיסון, T. R., וכו', גילוי נוגדנים מנטרלים ל-SARS-CoV-2 באמצעות דימוי פלואורסצנטי בסביבה של תפוקה גבוהה של זיהום בפסאודו-וירוס. J. Vis. Exp. (2021)

סרטון זה מתאר את בדיקת הלוחיות של נגיפים (virus plaque assay) באמצעות חלקיקי פסאודו-נגיף של נגיף הקורונה. הפסאודו-נגיף המדולל מתווסף לשכבה Ein-monolayer של תאי יונקים, ולאחר מכן מדגגנים עם שכבת כיסוי של מתילצלולוז. פלאקים (Plaques) שנוצרו על ידי תאים נגועים נספרים באופן חזותי כדי לקבוע את התר של הנגיף המדבק.

פרוטוקול

קביעת titer של פסאודו-וירוס vesicular stomatitis virus המבטא חלבון spike של קורונה וחלבון פלואורסצנציה ירוק משופר (VSV-S-eGFP)

1. דילול סדרתי לקביעת הטרה ויראלית

1. זרע תאי Vero E6 בפלטות של 6 בארות בצפיפות זריעה של 6 × 10⁵ תאים לבערה בתוך Dulbecco's Modified Eagle Medium או DMEM (עם 10% FBS (סרום עגל עוברי)), והדגר למשך לילה ב-37 °C עם 5% CO₂.

הערה: ניתן להשתמש גם בתאי Vero המבטאים ביתר TMPRSS2 ו-hACE2.

2. הכינו סדרת מיהולים סיריאליים של פי 10 של נגיף ה-VSV-SeGFP ב-DMEM קר ללא סרום, על ידי העברת 900 μL של מצע לשבעה מבחנות מיקרו-צנטריפוגה. סמנו את המבחנות ממספר 1 עד 7. הוסיפו 100 μL מהמלאי הנגיפי למבחנה הראשונה ובצעו ערבוב קצר בוורטקס. העבירו 100 μL מהנגיף המהול ממבחנה 1 למבחנה 2 ובצעו ערבוב קצר בוורטקס; המשיכו כך עד למבחנה 7.

3. שאבו את המצע מכל הבארות בצלחת 6-בארות המכילה תאי Vero E6, והחליפו אותו ב-500 μL של דלילויות 10⁵ עד 10⁷. דגרו את הצלחות למשך 45 min ב-37 °C עם 5% CO₂, תוך ניעור עדין בכל 15 min.

4. שאבו את האינוקולום והחליפו אותו בשכבת כיסוי המכילה תערובת של 1:1 של 2x DMEM ו-6% carboxymethyl cellulose (CMC), בריכוז סופי של 3% CMC, בתוספת 10% FBS; דגרו ב-34 °C עם 5% CO₂ למשך 48 h.

הערה: יש לחמם מראש את תערובת הכיסוי באמבט מים בטמפרטורה של 37 °C למשך 15 דקות במהלך שלב ההדבקה. ניתן להשתמש בתערובת של 1:1 של 1% agarose עם 2x DMEM מועשר ב-10% FBS במקום CMC. כדי ליצור כיסוי עם agarose, יש להרתיח 1% agarose (ב-dH₂O) ולערבב עם 2x DMEM קר. יש לוודא שהתערובת נמצאת בטמפרטורה מתאימה לפני הוספתה לשכבת התאים (בערך 37-40 °C). אם נעשה שימוש ב-agarose לכיסוי, יש לקבע את התאים על ידי הדגרה ב-2 mL של תערובת 3:1 methanol:acetic acid למשך שעה אחת לפחות לפני הצביעה.

2. צביעה וחישוב התר עם הנגיפי

1. הדמיות של הפלאקים תבוצעו על ידי צביעה ב-crystal violet או על ידי הדמיה ישירה של eGFP תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי.

2. כדי לצבוע את הפלטות, שאבו את שכבת הכיסוי, שטפו פעם אחת עם PBS, ולאחר מכן הוסיפו 2 mL של 0.1% crystal violet (ב-80% methanol ו-dH₂O) לכל באר. הניחו על נדנדה לפלטות למשך כ-20 min בטמפרטורת החדר לפני הסרת הצבע. הסירו את ה-crystal violet, ושטפו בעדינות כל באר פעמיים באמצעות dH₂O או PBS.

הערה: יש לבצע את שלבי השטיפה והצביעה בעדינות, על ידי פיפטור איטי לכיוון דופן כל באר, כדי להבטיח ששכבת התאים תישאר שלמה לאורך כל הפרוצדורה.

3. השאירו את הפלטות לייבוש למשך שעה אחת לפחות לפני ספירת הפלאקים. ודאו שספירת הפלאקים מתבצעת בבארים המכילות בין 20 ל-200 פלאקים. כדי לחשב את הטר של הנגיף ביחידות יוצרי פלאקים (PFU) ל-mL, הכפילו את מקדם הדילול של הבאר שנספרה בנפח ההדבקה, וחלקו את מספר הפלאקים הנמצאים בבאר המתאימה במספר זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
0.25% trypsin-EDTA (Gibco)	Fisher Scientific	LS25200114
תאי Vero E6	ATCC	CRL-1586
קרבוקסימתיל תרסלוז	Sigma	C5678
מצע דולבקו מודג'יפייד איגל (Gibco)	Fisher Scientific	10-013-CV
מצע דאלבקו המשתנה של איגל (אבקה) (Gibco)	Thermo Fisher Scientific	12-800-017
סליין עם חוצץ פוספט של דולבקו (DPBS)	Fisher Scientific	21-031-CV
פניצילין/סטרפטומיצין	Thermo Fisher Scientific	15070063
נוגדן מעבדה (Mab) לעכביה של חלבון Spike של SARS-CoV-2 (2019-nCoV), עכבר	SinoBiological	40592-MM57