כל ההליכים הכוללים איסוף דגימות בוצעו בהתאם להנחיות ה-IRB של המכון. דילול נוגדנים או סרום והדבקה הערה: ניתן להשתמש בפרוטוקול זה למדידת נטרול של פסאודו-וירוס של נגיף הסטומטיט הוסיקולרי המבטא את חלבון הספייק של נגיף הקורונה ואת חלבון הפלואורסצנציה הירוק המשופר (VSV-S-eGFP), הן באמצעות נוגדנים זמינים מסחרית והן באמצעות סרום של מטופלים, וכן סרום שנאסף מבעלי חיים לצורך מחקרי פיתוח חיסונים פרה-קליניים. סדרת דילולים לפני דילול דגימות הסרום, יש לבצע אינאקטיבציה תרמית של כל דגימה באמבט מים של 56 °C למשך 30 דקות כדי לנטרל את המשלים. יש להקפיד על נקיטת אמצעי בטיחות נחוצים בעת טיפול בדגימות מטופלים; יש לפתוח את מיכלי הדגימות אך ורק בתוך מנדף לתרביות רקמה, ולוודא לבישת ציוד מגן אישי רלוונטי לרמת ביטחון ביולוגי 2. הכינו את סדרת הדילולים בתוך פלטה ריקה של 96 בארות (פלטה 1). התחילו את כל הדילולים בשורה A של פלטת ה-96 בארות בנפח של 80 µL. *עבור דגימות מטופלים, התחילו את סדרת הדילולים ביחס של 1 ל-10 על ידי הוספת 8 µL של סרום לתוך 72 µL של מצע Dulbecco's modified eagle medium (DMEM) ללא סרום (עם 1% פניצילין/סטRepartition), (עם 1% פניצילין/סטרפטומייצין). הערה: ריכוז הנוגדן המנטרל שבו יעשו שימוש תלוי בפעילות החזויה על ידי היצרן. עבור הנוגדן המנטרל של Spike של SARS-CoV-2 שבו נעשה שימוש כאן (ראו את טבלת החומרים), התחילו עם 5 µg/mL כדי לצפות בנטרול של לפחות 50%. הוסיפו 40 µL של DMEM ללא סרום (עם 1% פניצילין/סטרפטומייצין) לשורות B עד G, ו-80 µL לשורה H. אין להוסיף וירוס לשורה H, שכן היא משמשת כביקורת של תאים בלבד. באמצעות פיפט רב-ערוצית של 12 ערוצים, ערבבו והעבירו 40 µL של סרום או נוגדן מדולל משורה A לשורה B. ערבבו וחזרו על הפעולה עד שורה F, ולאחר מכן השליכו 40 µL משורה F. אין להוסיף סרום לשורה G, שכן היא מייצגת את שורת ביקורת הווירוס בלבד. הדבקה ושכבת כיסוי הכינו נפח מתאים של VSV-S-eGFP מדולל לטיפול בכל בארה בריבוי הדבקה (MOI) של 0.05 (או 2000 יחידות יוצרות פלאק (pfu)). (בעת ביצוע חישוב זה, זכרו שרק 60 µL מתוך נפח כולל של 80 µL יועברו לתאים; לכן, הקפידו להכפיל את נפח הווירוס ב-1.33 כדי לשמור על 2000 pfu). הערה: מכיוון ש-VSV-S-eGFP רגיש לטמפרטורה, ודאו שמלאי הווירוס נשמר על קרח כאשר אינו בשימוש, והימנעו ממחזורי הקפאה-הפשרה מרובים שכן הטיטרים ישתנו לאחר הקפאות חוזרות. הוסיפו 40 µL של וירוס מדולל לכל בארה בשורות A עד G בפלטה 1 וערבבו על ידי פיפוט למעלה ולמטה 4-5 פעמים. דגרו את הפלטה למשך שעה אחת ב-37 °C עם 5% CO2. הוציאו את הפלטה המכילה תאים מהדגירה (פלטה 2), ושאבו בזהירות את המצע מכל הבארות. העבירו 60 µL של תערובת נוגדן/וירוס מפלטה 1 לפלטה 2, ודגרו למשך שעה אחת ב-37 °C עם 5% CO2, תוך נטילת הפלטה כל 20 דקות. השלימו את נפח כל בארה ב-140 µL של שכבת כיסוי המכילה carboxymethyl cellulose (CMC) ב-DMEM לריכוז סופי של 3% CMC (עם 10% FBS (סרום בקר עוברי) ו-1% פניצילין/סטרפטומייצין). הניחו את פלטה 2 בדגירה המכוונת ל-34 °C עם 5% CO2 למשך כ-24 שעות לפני הדמיון. הערה: חממו מראש את תערובת שכבת הכיסוי באמבט מים של 37 °C למשך 15 דקות במהלך שלב ההדבקה. 2. דמיון וכמימות (יום 3) דמיינו את הפלטות באמצעות מדמיון פלואורסצנטי אוטומטי (תוך שימוש במסנן fluorescein isothiocyanate (FITC) או במסנן חלופי עם אורך גל עירור של 488 ננומטר). כמתו את ההדבקה הווירוסית על ידי יצירת פרוטוקול המזהה וסופר באופן אוטומטי מוקדי eGFP (חלבון פלואורסצנציה ירוק משופר) בודדים. אם תכונת ספירה אוטומטית אינה זמינה, השתמשו בתוכנת ImageJ כדי לכמת את מספר מוקדי ה-eGFP. ג'יימיסון, T. R., ואחרים. גילוי נוגדנים מנטרלים של SARS-CoV-2 באמצעות דימות פלואורסצנטי בתפוקה גבוהה של זיהום בפסאודו-וירוס. .J Vis Exp. (2021)
סרטון זה מדגים ניטרול מתווך-נוגדנים של פסאודו-וירוסים הנושאים חלבוני ספייק של נגיף הקורונה באמצעות סרום של חולים, הנבדק באמצעות דימוי פלואורסצנטי בעוצמה גבוהה של שכבות חד-שכבתיות של תאי אפיתל מזוהמים.
