ניטור ביטוי גנים ספציפי לשלב בנגיף הווקסיניה באמצעות רפורטרים פלואורסצנטיים

תקציר

1. זריעת תאים הפרידו תאי HeLa מהפלטה ודללו במצע גידול (Dulbecco's Modified Eagle Medium [DMEM], 2 mM L-glut, 10% סרום בקר עוברי [FBS]) לריכוז של כ-2.0 x 10⁵ תאים/מ"ל. העבירו 100 מיקרוליטר לבאר בפלטה של 96 בארות בעלת דפנות שחורות ותחתית שקופה ושטוחה (20,000 תאים לבאר). דגרו את התאים למשך 24 שעות עד להגעה לקונפלואנציה באינקובטור בטמפרטורה של 37 °C ו-5% CO2. 2. הדבקת תאים דללו את הווירוסים והדביקו את התאים. הפשיתו את הווירוסים הפלואורסצנטיים TrpV (וירוס משולש; Venus מוקדם, mCherry בינוני, TagBFP מאוחר) ו-PLV (Venus ללא מקדם) ופרקו את הצברים באמצעות סוניקציה למשך 5 דקות. לחלופין, ניתן לערבב מלאי וירוס גולמי ביחס של 1:1 עם טריפסין בריכוז 0.25 מ"ג/מ"ל במצע הדבקה ו לדגור ב-37 °C למשך 30 דקות. דללו את מלאי הווירוס הגולמי במצע הדבקה בטמפרטורה של 37 °C (DMEM, 2 mM L-glut, 2% FBS). להדבקות ב-MOI גבוה (10 PFU לתא), דללו את מלאי הווירוס ל-1.0 x 10⁷ PFU/מ"ל, בהנחה של 5 x 10⁴ תאים לבאר ונפח אינוקולום של 50 מיקרוליטר. תכננו להדביק 3 בארות חזרתיות לכל טיפול עם TrpV ו-3 בארות חזרתיות נוספות לאותו טיפול עם PLV, כדי להסיר את רעש הרקע הפלואורסצנטי הספציפי לכל טיפול. הדביקו את הבארות על ידי הוספת 50 מיקרוליטר לבאר של וירוס מדולל במצע הדבקה. נקודת זמן זו מוגדרת כזמן = 0 שעות לאחר ההדבקה (0 hpi). דגרו למשך 6-24 שעות באינקובטור בטמפרטורה של 37 °C ו-5% CO2. 3. קיבוע תאים קבעו את התאים על ידי הוספת 100 מיקרוליטר של פראפורמאלדהיד 8% למצע ההדבקה שכבר נמצא בכל באר. דגרו בטמפרטורת החדר למשך 15 דקות תוך הגנה מאור. הערה: מומלץ להוסיף פראפורמאלדהיד 2x (8%) ישירות למצע ההדבקה כדי למנוע היווצרות רסס של וירוס vaccinia מדבק, דבר שעלול להתרחש אם מרוקנים מצע בעל טטר גבוה ישירות לכלי הפסולת לפני הקיבוע. הסירו את חומר הקיבוע על ידי הפיכת הפלטה לתוך כלי הפסולת. הוסיפו 100 מיקרוליטר של פוספט-בופר סליין (PBS) בטמפרטורת החדר. אטמו את הפלטה בעזרת סרט דביק שקוף אופטית. הערה: ניתן לאחסן פלטות ב-4 °C אם הן אינן נקראות באופן מיידי. הקפידו להחזיר פלטות אטומות לטמפרטורת החדר לפני הקריאה כדי למנוע מעיבוי מים להשפיע על מדידות הספקטרופוטומטר. רוזל, ד. ק., ואחרים. וירוסי דווח של Vaccinia לכימות תפקוד ויראלי בכל שלבי ביטוי הגנים. .J. Vis. Exp (2014)

סרטון זה מדגים שיטה לניטור רבייה של נגיף הווקסיניה (vaccinia virus) באמצעות רפורטרים פלואורסצנטיים המוסדרים על ידי פרומוטורים ספציפיים לשלב. ביטוי רצפי של חלבונים פלואורסצנטיים בירוק, אדום וכחול מסמן את השלבים המוקדם, הבינוני והמאוחר של הזיהום, ובכך מאפשר ניתוח בסריקה רחבה (high-throughput) של ביטוי גנים נגיפיים ספציפיים לשלב.

פרוטוקול

1. זריעת תאים

1. נתק תאי HeLa מהפלטה ודלל אותם במצע גידול (Dulbecco's Modified Eagle Medium [DMEM], 2 mM L-glut, 10% fetal bovine serum [FBS]) לריכוז של כ-2.0 x 10⁵ תאים/מ"ל. חלק 100 μl לבאר בפלטת 96 בארות בעלת דפנות שחורות ותחתית שקופה ושטוחה (20,000 תאים לבאר).
2. דגור את התאים למשך 24 שעות עד להגעה למצב של התלכדות (confluency) באינקובטור בטמפרטורה של 37 °C ו-5% CO₂.

2. הדבקת תאים

1. דללו את הווירוסים והדביקו את התאים.
   1. הפשירה את הווירוסים הפלורסצנטיים TrpV (Triple virus; Early Venus, Intermediate mCherry, Late TagBFP) ו-PLV (Promoter-less Venus) ובצעו פירוק אגראגטים באמצעות סוניקציה למשך 5 דקות. לחלופין, ניתן לערבב מלאי וירוס גולמי ביחס של 1:1 עם 0.25 mg/ml trypsin במדיום הדבקה ולהדגיר ב-37 °C למשך 30 דקות.
   2. דללו את מלאי הווירוס הגולמי במדיום הדבקה ב-37 °C (DMEM, 2 mM L-glut, 2% FBS). עבור הדבקות ב-MOI גבוה (10 PFU/cell), דללו את מלאי הווירוס לריכוז של 1.0 x 10⁷ PFU/ml, בהנחה של 5 x 10⁴ תאים לבאר ונפח אינוקולום של 50 μl. תכננו להדביק 3 בארות חזרתיות עבור כל טיפול באמצעות TrpV ו-3 בארות חזרתיות נוספות עבור אותו טיפול באמצעות PLV, כדי להגדיר את הפלורסצנציית הרקע הספציפית לכל טיפול.
   3. הדביקו את הבארות על ידי הוספת 50 μl/well של וירוס מדולל במדיום הדבקה. נקודה זו מוגדרת כזמן = 0 שעות לאחר ההדבקה (0 hpi).
2. הדגירו למשך 6-24 שעות באינקובטור ב-37 °C + 5% CO₂.

3. קיבוע תאים

1. קבעו את התאים על ידי הוספה של 100 μl פראפורמאלדהיד 8% למצע ההדבקה שכבר נמצא בכל באר. דגרו בטמפרטורת החדר למשך 15 min תוך הגנה מאור.
   הערה: מומלץ להוסיף פראפורמאלדהיד (8%) בריכוז 2x ישירות למצע ההדבקה כדי למנוע התזת אירוסול של נגיפי vaccinia זיהומיים, דבר שעלול להתרחש אם מצע עם titer גבוה נשפך ישירות לכלי הפסולת לפני הקיבוע.
2. הסירו את חומר הקיבוע על ידי הפיכת הפלטה לתוך כלי הפסולת.
3. הוסיפו 100 μl של פוספייט-בפר (phosphate-buffered saline) בטמפרטורת החדר.
4. אטמו את הפלטה בעזרת סרט דביק שקוף אופטית.
   הערה: ניתן לשמור פלטות בטמפרטורה של 4 °C אם אינן נקראות באופן מיידי. יש להחזיר את הפלטות האטומות לטמפרטורת החדר לפני הקריאה כדי למנוע מעיבוי (condensation) לעוות את מדידות הספקטרופוטומטר.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)	Gibco	11995-065
סרום עגל עוברי - Optima, שעבר אינאקטיבציה תרמית (FBS)	Atlanta Biologicals	S12450H
200 mM L-Glutamine, (L-glut)	Gibco	25030-081
מיקרופלטות 96 בארות עם תחתית שקופה שטוחה מפוליסטירן שחור שעברו טיפול TC	Corning	3603
מלח פוספט רב-ערכי (PBS)	Gibco	10010-023
סרט TempPlate RT שקוף אופטית	USA Scientific	2978-2700
מדיום Opti-MEM עם סרום מופחת	Gibco	31985-070