בידוד וטיהור של נגיפים מגופי חרקים נגועים

תקציר

מיצוי נגיף שלם הומגניזציה של גופים שלמים של *H. vitripennis* חיוביים לנגיף בבופר פוספט, pH ~7.2, עם 0.02% sodium diethyldithiocarbamate trihydrate (DETCA), באמצעות וורטקס במרווחי זמן של כ-10 שניות עד שלא יישארו גושי רקמה גדולים. מיצוי הנגיף יתבצע באמצעות סנטריפוגה במהירות גבוהה (superspeed centrifugation) ב-124,500 x g למשך 4 שעות ב-4 °C או ב-22,000 x g למשך 16 שעות ב-4 °C. אם נוצר משקע בחלק העליון, יש להסירו באמצעות מקלון צמר סטרילי. יש להשליך את הנוזל העליון (supernatant). איסוף המשקע (pellet) והמסתו ב-5 מ"ל בופר פוספט 10 mM (ללא DETCA), pH ~7.2, המכיל 0.4% Na-deoxycholic acid ו-4% polyethylene glycol hexadecyl ether (Brij 52). כדי לערבב את המשקע היטב, יש להסיר אותו מדופן המבחנה ולמעוך אותו עד להמסתו בתמיסה, במידת הצורך. יש להוסיף בופר פוספט 10 mM נוסף במרווחים של כ-5 מ"ל כדי לסייע להמסת המשקע במידת הצורך, ולחלק את התוצאה לשתי מבחנות. סנטריפוגה של התמיסה ב-300 x g למשך 15 דקות. יש להסיר את הנוזל העליון ולהעביר את התמיסה דרך מסנן של 0.45 μm, ולאסוף את התסנין (filtrate) למבחנת איסוף גדולה. העברת התסנין לממברנת דיאליזה עם סף חיתוך של משקל מולקולרי (MWCO) של 3.5 kD, תוך שימוש בכמויות קטנות של בופר פוספט 10 mM (pH 7) ללא DETCA במידת הצורך. יש להניח את ממברנת הדיאליזה בכלי זכוכית (beaker) גדול מלא ב-ddH2O בטמפרטורה של 4 °C. יש להחליף את ה-ddH2O מדי שעה למשך 5 עד 6 שעות, עד להיווצרות משקע לבן בממברנה. איסוף הנגיף המזוקק מתוך הממברנה, וביצוע סדרת דילול של פי 10 לתמיסת הנגיף (100%) על ידי הוספת 10 μl מהתמיסה ל-90 μl של ddH2O. לאחר מכן, יש להוסיף 10 μl מהדילול ל-90 μl נוספים של ddH2O עד להגעה לדילול של 1:100,000. יש לאחסן את תמיסת הנגיף בטמפרטורה של -80 °C. Biesbrock, A. M. ועמיתיהם התרבות של Homalodisca coagulata virus-01 באמצעות Homalodisca vitripennis תרבית תאים. .J. Vis. Exp (2014)

סרטון זה מדגים את ההרבייה במעבדה (in vitro) של Homalodisca coagulata Virus-01 באמצעות תאי מאכסן ממקור חרקי. הוא מפרט את השלבים של טיהור הווירוס, החדרתו ושכפולו בתוך תאי חרקים בתרבית.

פרוטוקול

1. מיצוי נגיף שלם

1. בצעו הומוגנציה של גופים שלמים של H. vitripennis חיוביים לנגיף בבופר פוספט, pH ~7.2, עם 0.02% sodium diethyldithiocarbamate trihydrate (DETCA) באמצעות וורטקס במרווחי זמן של ~10 sec עד שלא יישארו גושים גדולים של רקמה. הוציאו את הנגיף באמצעות סנטריפוגה במהירות גבוהה (superspeed centrifugation) ב-124,500 x g למשך 4 hr ב-4 °C או ב-22,000 x g למשך 16 hr ב-4 °C. אם נוצר משקע בחלק העליון, הסירו אותו בעזרת מקלון צמר סטרילי.
2. שפכו את הנוזל העליון (supernatant).
3. אספו את המשקע (pellet) והמיסו אותו ב-5 ml של בופר פוספט 10 mM (ללא DETCA), pH ~7.2, המכיל 0.4% Na-deoxycholic acid ו-4% polyethylene glycol hexadecyl ether (Brij 52).
   1. כדי לערבב את המשקע היטב, הסירו אותו מדופן המבחנה ומעכו אותו עד להמסה מלאה, במידת הצורך.
   2. הוסיפו בופר פוספט 10 mM נוסף במנות של ~5 ml כדי לסייע להמסת המשקע במידת הצורך, וחלקו את התמיסה לשתי מבחנות.
4. סנטריפוגו את התמיסה ב-300 x g למשך 15 min.
5. הסירו את הנוזל העליון והעבירו את התמיסה דרך מסנן של 0.45 μm, ואספו את התסנין (filtrate) למבחנת איסוף גדולה.
6. העבירו את התסנין לממברנת דיאליזה עם סף משקל מולקולרי (MWCO) של 3.5 kD, תוך שימוש בכמויות קטנות של בופר פוספט 10 mM (pH 7) ללא DETCA במידת הצורך.
7. הניחו את ממברנת הדיאליזה בכלי כימי גדול מלא ב-ddH₂O ב-4 °C. החליפו את ה-ddH₂O בכל שעה למשך 5 - 6 hr, עד להיווצרות משקע לבן בממברנה.
8. אספו את הנגיף המזוקק מתוך הממברנה והעבירו את תמיסת הנגיף בריכוז 100% לסדרת מהלולים של פי 10, על ידי הוספת 10 μl של תמיסה ל-90 μl של ddH₂O. לאחר מכן, הוסיפו 10 μl מהמהול ל-90 μl נוספים של ddH₂O עד להשגת מהילה של 1:100,000.
9. שמרו את תמיסת הנגיף ב- -80 °C.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
Corning cell culture flasks	Sigma Aldrich	CLS430168	שטח פנים 25 cm², צוואר נטוי, פקק (אטם פקק)
Olympus DP30BW, IX2-SP, IX71	Olympus		מיקרוסקופ הפוך ומצלמה
Greiner CELLSTAR multiwell culture plates	Sigma Aldrich	M8937	48 בארות (טיפול TC עם מכסה)
DETCA	Sigma Aldrich	228680	Sodium diethyldithiocarbamate trihydrate
Corning bottle-top vacuum filter system	Sigma Aldrich	CLS431206	ממברנת Cellulose acetate, גודל נקבוביות 0.45 μm, שטח ממברנה 54.5 cm², קיבולת סינון 500 ml
Brij 52	Sigma Aldrich	388831	Polyethylene glycol hexadecyl ether
Phosphate buffer solution	Sigma Aldrich	P5244	התקבל בריכוז 100 mM ודולל ל-10 mM עם מים סטריליים
PBS	Sigma Aldrich	P5368	Phosphate buffered saline
Bovine serum albumin (BSA)	Sigma Aldrich	A2153
Grace’s Insect medium (supplemented, 1x)	Sigma Aldrich	G8142	רכיב למצע גידול H2G+ לקצירנים
L-histidine monohydrate	Sigma Aldrich	H8125	רכיב למצע גידול H2G+ לקצירנים
Medium 199 (10x)	Sigma Aldrich	M4530	רכיב למצע גידול H2G+ לקצירנים
Medium 1066 (1x)	Sigma Aldrich	C0422	רכיב למצע גידול H2G+ לקצירנים
Hank’s Balanced Salts (1x)	Sigma Aldrich	51322C	רכיב למצע גידול H2G+ לקצירנים
L-Glutamine (100x)	Sigma Aldrich	G3126	רכיב למצע גידול H2G+ לקצירנים
MEM, amino acid mix (50x)	Sigma Aldrich	56419C	רכיב למצע גידול H2G+ לקצירנים
1 M MgCl solution	Sigma Aldrich	M8266	רכיב למצע גידול H2G+ לקצירנים
Pen-Strep	Sigma Aldrich	G6784	רכיב למצע גידול H2G+ לקצירנים
Nystatin	Sigma Aldrich	N6261	רכיב למצע גידול H2G+ לקצירנים
Gentamycin	Sigma Aldrich	46305	רכיב למצע גידול H2G+ לקצירנים
Dextrose	Sigma Aldrich	D9434	רכיב למצע גידול H2G+ לקצירנים
Fetal Bovine Serum	Sigma Aldrich	F2442	רכיב למצע גידול H2G+ לקצירנים