בניית מערכת אריזה של לנטיווירוס מרוכז עבור גורמי שעתוק ייצור הווירוס המרוכז (איור 1A, B) 1. זרע 1.5 × 10⁶ תאי HEK (כליה עוברית אנושית)-293T לצלחית של 60 מ"מ וגדל תאים אלו במצע רגיל (ראה טבלה 1) בטמפרטורה של 37 °C באינקובטור לח עם 5% CO2. הערה: אם יש צורך לארוז את הווירוס במנות, ניתן להשתמש בצלחמת תרבית תאים של 100 מ"מ (לפרטים, ראה טבלה 2). 2. לאחר 24 שעות, ודא שתאי ה-HEK-293T הגיעו ל-80-90% התמזגות (confluence) ביום התעתוק, והחלף את המצע ב-3.5 מ"ל של DMEM (מצע דולבקו משופר) (150 µL של DMEM לכל 1 סמ"ר). השאר את התאים בטמפרטורה של 37 °C באינקובטור לח עם 5% CO2 למשך שעתיים. הערה: המצע המחליף חייב להיות נטול סרום, כדי שהתאים יוכלו לעבור "הרעבה" לטרנספקציה טובה יותר של הפלסמידים. 3. הכן את תערובת הפלסמידים (תערובת A) המכילה 3 µg מהפלסמידים של המטרה Mitf, Sox10, Pax3, Sox2, Sox9 או Snai2; 1 µg מהפלסמיד האריזה PMD2.G, ו-2 µg מהפלסמיד האריזה PSPAX2. השלם את נפח תערובת A ל-150 µL באמצעות DMEM נטול סרום. הכן את תערובת רכיב הטרנספקציה (תערובת B) על ידי הוספה של 12 µL מרכיב הטרנספקציה (הנפח הוא כפול מהמסה הכוללת של כל הפלסמידים), והשלם את נפח תערובת B ל-150 µL באמצעות DMEM נטול סרום. הערה: בעת הכנת התערובות, חשוב להוסיף את הנוזל לאט כדי למנוע בועות אוויר. 4. שלב את תערובת A ותערובת B לאחר שהשארתן למשך 5 דקות בטמפרטורת החדר. דגור את התערובת בטמפרטורת החדר למשך 20-30 דקות כדי ליצור את קומפלקס הטרנספקציה. 5. הוצא את תאי ה-HEK-293T מהאינקובטור, החלף את המצע ב-DMEM + 2% FBS (סרום בקר עוברי), הוסף את התערובת משלב 1.1.4 בטפטוף, וערבב את הנוזל בעדינות. 6. לאחר 8 שעות, החלף את המצע ב-3.5 מ"ל של מצע רגיל. לאחר החלפת המצע, אסוף את העליון (supernatant) של הווירוס בכל 24 ו-48 שעות. 7. ערבב את העליונים של הווירוס שנאספו בשתי נקודות זמן שונות. סבב בצנטריפוגה במהירות של 200 × g למשך 5 דקות ב-4 °C. העבר את העליון דרך מסננים של 0.45 µm ואסוף אותו למבחנה קונית סטרילית של 50 מ"ל. הערה: את הווירוס שנאסף ב-24 שעות ניתן לשמור ב-4 °C ולערבב עם הווירוס שנאסף ב-48 שעות. 8. רכז את העליון של הווירוס על ידי סבב בצנטריפוגה במהירות 6000 × g ב-4 °C למשך לילה (~16 שעות). ודא שמשקע הווירוס נראה בתחתית המבחנה הקונית לאחר הסבב. 9. שפוך את העליון לאט. המס את משקע הווירוס בנפח של מצע רגיל השווה ל-1/100 מהנפח של העליון של הווירוס. באמצעות מיקרופיפט P1000, בצע פיפטינג למעלה ולמטה בעדינות עד לקבלת תערובת הומוגנית. חלק את הווירוס המרוכז למבחנות מיקרוצנטריפוגה לפי הצורך. שמור ב-80 °C-. הערה: הווירוס מרוכז פי 100 בשיטה זו. ניתן לשמור את הווירוס המרוכז (פי 100) למשך יותר משנה ב-80 °C-. הימנע מהקפאה והפשרה חוזרת של הווירוס. טבלה 1: רכיבים של מצעים רגילים ומצעי תכנות מחדש. רכיבים | מינון (ריכוז, נפח) | ריכוז סופי מצע רגיל (100 מ"ל) | | DMEM/HIGH GLUCOSE | 89 מ"ל | FBS מושבת בחום | 10 מ"ל | אנטיביוטיקה (Pen/Strep) | 10000 U/mL, 1 מ"ל | 100 U/mL מצע תכנות מחדש (100 מ"ל) | | RPMI-1640 | 88 מ"ל | FBS מושבת בחום | 10 מ"ל | SCF אנושי רקומביננטי | 200 μg/mL, 50 μL | 100 ng/mL bFGF אנושי רקומביננטי | 4 μg/mL, 250 μL | 10 ng/mL אינסולין אנושי רקומביננטי | 10 mg/mL, 50 μL | 5 μg/mL EDN3 אנושי | 100 μM, 100 μL | 0.1 μM רעלן כולרה (Cholera Toxin) | 0.3 mg/mL, 0.56 μL | 20 pM פורבול 12-מיריסטאט 13-אצטט (TPA) | 1 mM, 20 μL | 200 nM הידרוקורטיזון | 100 μg/mL, 500 μL | 0.5 μg/mL אדנין | 40 mg/mL, 60 μL | 24 μg/mL טבלה 2: פרטי מערכת אריזת הלנטיווירוס. צלחמת תרבית | צפיפות זריעה (תאים/צלחית) | מצע (מ"ל) | מערכת פלסמידים | רכיב טרנספקציה (µL) | פלסמיד מטרה (μg) | PMD2.G (μg) | PSPAX2 (μg) 35 מ"מ | 6 × 10⁵ | 1.5 | 1.5 | 0.5 | 1 | 6 | 6 60 מ"מ | 1.5 × 10⁶ | 3.5 | 3 | 1 | 2 | 1 | 2 100 מ"מ | 4 × 10⁶ | 8 | 8 | 3 | 6 | 3 | 4 ז'אנג, Y., וכס׳תכנות מחדש ישיר של פיברובלסטים של עכבר למלנוציטים. J. Vis. Exp. (2021)
סרטון זה מדגים את הייצור והריכוז של לנטיווירס רקומביננטי בתאי יונקים, המאפשר העברה יעילה של גנים של גורמי שעתוק או אלמנטים גנטיים אחרים עבור יישומים כגון תכנות מחדש של תאים, מחקרים תפקודיים ומחקר טיפולי פוטנציאלי.
