ייצור של חלקיקים דמויי נגיף בעלי יכולת שעתוק ושכפול של נגיף האבולה המכילים רפורטר

תקציר

טרנספקציה של תאי יצרן לייצור ראשוני של חלקיקים דמויי נגיף בעלי יכולת שעתוק ושכפול (trVLPs) 24 שעות לאחר פיצול התאים (ראו איור 1 לסקירה של לוחות הזמנים של הניסוי), העבירו בעזרת פיפט DNA פלסמידי (לכמויות ראו טבלה 1) למבחנה קריוגנית סטרילית של 2 מ"ל באמצעות טיפים מסוננים. הוסיפו ל-DNA כ-100 µL של OptiMEM לכל באר. ערבבו את התערובת בקצרה באמצעות וורטקס וסובבו את המבחנות בעדינות במיקרופוג'ה להורדת הנוזל. אם יש לבצע טרנספקציה למספר בארות עם פלסמידים זהים, ניתן להכין תערובת מאסטר (master mix) למספר בארות. ערבבו בקצרה את מבחנת ה-Transit LT1 באמצעות וורטקס לפני השימוש. הוסיפו 7.5 µL של Transit LT1 לכל באר ל-DNA המדולל. ערבבו בעדינות את התערובת בוורטקס, תוך הקפדה שלא להצטבר נוזל במכסה של המבחנה הקריוגנית, והדגירו למשך 15 דקות בטמפרטורת החדר. ערבבו בעדינות את קומפלקס הטרנספקציה על ידי שאיבה והוצאה של הנוזל בפיפט. הוסיפו בטפטוף 100 µL מקומפלקסי הטרנספקציה לכל באר. נדנדו את הפלטה קדימה/אחורה ומצד לצד כדי לפזר את קומפלקסי הטרנספקציה. אין לסובב את הפלטה בתנועה סיבובית, שכן הדבר יגרום לפיזור לא אחיד של קומפלקסי הטרנספקציה. החזירו את התאים לאינקובטור. לאחר 24 שעות, הסירו את העלייה (supernatant) מהתאים. הוסיפו לתאים 4 מ"ל DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium) עם 5% FBS (סרום עגל עוברי), 2 mM L-glutamine, ו-1x pen/strep (פניצילין/סטרפטומייסין) (DMEM5). ניתן לבצע שלב זה עבור עד 3 בארות בו-זמנית ללא חשש מהתייבשות הבארות, בהנחה שהבארות מכילות דגימות זהות (אחרת, בשל אופי השכפול העצמי של ה-trVLPs (חלקיקים דמויי נגיף בעלי יכולת שעתוק ושכפול) במערכת זו, עלולה להיווצר בעיית זיהום צולב, ובמקרה כזה יש לבצע שלב זה בבאר אחת בכל פעם). החזירו את התאים לאינקובטור. טבלה 1. כמויות DNA לטרנספקציה. כמות כל פלסמיד הנדרשת לטרנספקציה של תאי יצרן ותאי מטרה מוצגת ב-ng לכל באר בפלטה של 6 בארות. | תאי יצרן (p0) | תאי מטרה (p1 ומעלה) | | :--- | :--- | | pCAGGS-NP: 125 | 125 | | pCAGGS-VP35: 125 | 125 | | pCAGGS-VP30: 75 | 75 | | pCAGGS-L: 1,000 | 1,000 | | p4cis-vRNA-RLuc: 250 | - | | pCAGGS-T7: - | 250 | | pCAGGS-Tim1-2: - | 250 | הונן, T., וכדומה. מידול מחזור החיים של נגיף האבולה תחת תנאי רמת בטיחות ביולוגית 2 באמצעות חלקיקים דמויי נגיף המכילים מיני-גנומים טטראציסטרוניים. .J. Vis. Exp (2014)

סרטון זה מדגים כיצד פלסמיד מיני-גנום טטרה-סיסטרוני המדמה את הגנום של נגיף האבולה מותמר לתאים אנושיים יחד עם פלסמידי עזר. בתוך התאים, מובעים חלבונים ויראליים ולוסיפראז, מה שמוביל להרכבה ולניבוב של חלקיקים דמויי נגיף (virus-like particles) שאינם פתוגניים ומסוגלים לשכפול.

פרוטוקול

1. טרנספקציה של תאי יצרן לייצור ראשוני של חלקיקים דמויי נגיף בעלי יכולת שעתוק ושכפול או trVLPs

1. 24 שעות לאחר פיצול התאים (ראה איור 1 לסקירה כללית של לוחות הזמנים של הניסוי), העבר באמצעות פיפט DNA פלסמידי (לכמויות ראה טבלה 1) למבחנת קריו (cryovial) סטרילית של 2 mL תוך שימוש בטיפים מסוננים. הוסף 100 µL OptiMEM לכל באר אל ה-DNA. ערבב את התערובת ב-vortex לזמן קצר וסבב בעדינות את המבחנות במיקרופוגה (microfuge) להסמכה. אם יש להעביר טרנספקציה לכמה בארות עם פלסמידים זהים, ניתן להכין תערובת מאסטר (master mix) עבור מספר בארות.
2. ערבב ב-vortex לזמן קצר את מבחנת ה-Transit LT1 לפני השימוש. הוסף 7.5 µL Transit LT1 לכל באר אל ה-DNA המדולל. ערבב בעדינות את התערובת ב-vortex, תוך הקפדה שלא יצטבר נוזל במכסה של מבחנת הקריו, והדגר למשך 15 דקות בטמפרטורת החדר.
3. ערבב בעדינות את קומפלקס הטרנספקציה על ידי פיפטור מעלה ומטה. הוסף 100 µL מקומפלקסי הטרנספקציה בטיפות לכל באר. נדנד את הפלטה קדימה/אחורה ומצד לצד כדי לפזר את קומפלקסי הטרנספקציה. אין לסובב את הפלטה כיוון שזה יגרום לפיזור לא אחיד של קומפלקסי הטרנספקציה.
4. החזר את התאים לאינקובטור.
5. לאחר 24 שעות, הסר את העליון (supernatant) מהתאים. הוסף לתאים 4 mL DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium) עם 5% FBS (Fetal Bovine Serum), 2 mM L-glutamine, 1x pen/strep (Penicillin/Streptomycin) (DMEM5). ניתן לבצע שלב זה עבור עד 3 בארות בבת אחת ללא ייבוש של הבארות, בהנחה שהבארות מכילות דגימות זהות (אחרת, בשל טבעם של ה-trVLPs (Transcription- and Replication-Competent Virus-Like Particles) במערכת זו, שהם בעלי יכולת הגברה עצמית, עלולה להיווצר בעיית זיהום צולב, ובמקרה זה יש לבצע שלב זה בבאר אחת בכל פעם).
6. החזר את התאים לאינקובטור.

טבלה 1. כמויות DNA לטרנספקציה. הכמות של כל פלסמיד הנדרשת לטרנספקציה של תאי יצרן ותאי מטרה מוצגת ב-ng לבאר בלוח של 6 בארות.

	Producer Cells (p0)	Target Cells (p1 and higher)
pCAGGS-NP	125	125
pCAGGS-VP35	125	125
pCAGGS-VP30	75	75
pCAGGS-L	1,000	1,000
p4cis-vRNA-RLuc	250	-
pCAGGS-T7	250	-
pCAGGS-Tim1	-	250

תוצאות

איור 1. לוח זמנים של בדיקת trVLP טטרציסטרונית עבור 3 מעברים רצופים. הימים להזרעת תאים (s), טרנספקציית תאים (t), הדבקת תאים (i), החלפת מצע (c) וקציר של תאים ו-trVLPs (h) מסומנים עבור שלושה מעברים רצופים (מסומנים על ידי חצים).

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
בקבוק לתרבית תאים 75 cm²	Corning	430641
DMEM	Sigma	D6546	יש לחמם מראש ל-37°C לפני השימוש
FBS	Life technologies	26140-079	אינאקטיבציה תרמית למשך 30 min ב-56°C
L-Glutamine	Life Technologies	25030-081	100x
Pen/strep	Life Technologies	15070-063	100x
פלטות 6 בארות	Costar	3516
Opti-MEM I	Life Technologies	31985-070
Transit LT1	Mirus	MIR 2300