בדיקה מבוססת לוציפראז להערכת תרכובות אנטי-ויראליות בתאי כליה עובריים אנושיים

תקציר

1. הכנת תרביתי תאים המודבקים בנגיח חצבת (MV) המבטא לוקיפראז גחלילי (rMV2/Luc) גדלו תאי HEK-293T בטמפרטורה של 37 °C וב-5% CO2 במצע Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM) עם L-glutamine מיוצב, בתוספת 10% סרום עגל עוברי (FCS), סטרפטומייסין (100 μg/ml) ופניצילין (100 IU/ml). את התאים מעבירים למצע חדש (passage) על ידי טריפסינציה כל 4-5 ימים, בדילול של 1:10 לבקרה נקייה. התאים צריכים להיות בשלב הלוגריתמי (log phase) עבור הניסויים. ביום הניסוי, השקיפו את התאים על ידי טריפסינציה ובצעו ספירת תאים. השקיעו את התאים על ידי סנטריפוגה, ותלו אותם מחדש בריכוז של 3 x 10⁵ תאים/מ"ל במצע תרבית. קחו בחשבון שנדרשים 12.5 מ"ל של תסבי תאים עבור כל פלטת סריקה. שוב, תלו את התאים מחדש בריכוז של 3 x 10⁵ תאים/מ"ל במצע תרבית. קחו בחשבון שנדרשים 12.5 מ"ל של תסבי תאים עבור כל פלטת סריקה. אופציונלי: הוסיפו למצע התרבית uridine בריכוז של 20 μg/ml. הערה: בעת סריקת ספריות כימיות למציאת מעכבים של שכוול נגיפי, נראה כי מבודדים לעיתים קרובות תרכובות המכוונות לשלבים מוקדמים של נתיב הביוסינתזה של פירימידין. הוספת uridine למצע התרבית משמשת כדי לסנן מולקולות אנטי-ויראליות כאלה. אכן, פעולה זו משחזרת ביעילות את השכוול הנגיפי כאשר אנזימים שמעלה בנתיב הביוסינתזה של פירימידין חסומים. שמרו 1:10 מתסבי התאים עבור בארי בקרה עם תאים שאינם מודבקים, והמשיכו להדבקה עם השארית של הנפח. הפשיר את הנפח המתאים של תמיסת המקור של rMV2/Luc. תמיסות מקור של MV הן בדרך כלל בריכוז של 10⁶-10⁸ חלקיקים מדבקים למ"ל. יש להדביק את התרבית ב-0.1 חלקיקים מדבקים של rMV2/Luc לכל תא מטרה, מה שמת corresponds לריבוי הדבקה (MOI) של 0.1. הערה: rMV2/Luc נגזר מחיסון MV (זן Schwarz) ויש לטפל בו בסביבת BSL2. הוסיפו את הנגיף לתסבי התאים וערבבו בעדינות. העבירו את התאים המודבקים לאמבטיה (trough), וחלקו 100 μl של תסבי תאים מודבקים לעמודות 2 עד 11 של פלטות D2 המכילות תרכובות כימיות מתוספות. ערבבו את תסבי התאים שבתוך האמבטיה בעדינות ובאופן קבוע. בעמודות 1 ו-12, חלקו 100 μl של תאים שאינם מודבקים לכל באר. תאים מודבקים יחולקו לשאר הבאריים. דגרו את התאים למשך 24 שעות ב-37 °C וב-5% CO2. 2. סריקה שניונית לרעילות ופעילות אנטי-ויראלית רחבת-ספקטרום הכינו דילולות סדרתיות של 1:2 עבור כל תרכובת "פגיעה" (hit compound) ב-dimethylsulfoxide (DMSO), החל מ-500 µM ועד 4 µM (8 דילולות). מלאו פלטות תרבית רקמה לבנות עם ברקוד ב-50 µl של מצע תרבית. הוסיפו 1 µl מכל דילול של התרכובת לבארי התרבית. חזרו על הפעולה פעמיים כדי לקבל 3 פלטות תרבית עם דילולות סדרתיות כפולות עבור כל תרכובת פגיעה. הכינו 37.5 מ"ל של תסבי תאי HEK-293T בריכוז של 6 x 10⁵ תאים/מ"ל במצע תרבית כפי שמתואר לעיל (בסעיפים 1.1 ו-1.2). חלקו 2 פעמים 12.5 מ"ל לתוך מבחנות Falcon והדביקו את התאים באמצעות rMV2/Luc ב-MOI = 0.1 או נגיף צ'יקונגוניה רקומביננטי (CHIKV) המבטא לוקיפראז רנילה (CHIKV/Ren) ב-MOI = 0.2. ערבבו על ידי היפוך. הערה: CHIKV/Ren נגזר מזן פראי של CHIKV ולכן יש לטפל בו בסביבת BSL3. ניתן להעביר את הפלטות מ-BSL3 ל-BSL1 לאחר הוספת תסביס רנילה לבארי התרבית (ראו להלן). חלקו 50 µl של תאים שאינם מודבקים, תאים מודבקי rMV2/Luc או תאים מודבקי CHIKV/Ren לפלטות תרבית המכילות דילולות סדרתיות של תרכובות פגיעות. דגרו למשך 24 שעות ב-37 °C. הוסיפו 50 µl של תסביס לוקיפראז גחלילי כדי לקבוע את פעילות הלוקיפראז הגחלילי בבאריים המודבקים ב-rMV2/Luc. הוסיפו 50 µl של תסביס לוקיפראז רנילה כדי לקבוע את פעילות לוקיפראז רנילה בבאריים המודבקים ב-CHIKV/Ren. לבסוף, הוסיפו 50 µl של ריאגנט לבדיקת חיוניות מבוססת לוקיפראז לתאים שאינם מודבקים כדי לקבוע את החיוניות התאית. שרטטו את הנתונים (איור 1) וקבעו את ריכוזי התרכובות הפגיעות המעכבות את שכוול ה-MV וה-CHIKV ב-50%. התעלמו מתרכובות המראות רעילות מסוימת בבדיקה זו. לוקאס-חוראני, מ'. וכדומה, סריקה בייצור רב (High-throughput Screening) למציאת מעכבים כימיים רחבי-טווח של נגיפי RNA. J. Vis. Exp. (2014)

סרטון זה מציג בדיקה אנטי-ויראלית מבוססת לוקיפראז בתאי כליה עובריים אנושיים שהודבקו בנגיף חצבת רקומביננטי. הסרטון מדגים כי תרכובות בדיקה בדילול סדרה מעכבות את השכפול הנגיפי, מה שמוביל ללומניסנציה נמוכה יותר באופן תלוי מינון, תוך שמירה על חיוניות תאי המארח.

פרוטוקול

1. הכנת תרביות תאים המודבקים בנגיף החצבת (MV) המבטא לוסיפראז גחלילית (rMV2/Luc)

1. גדלו תאי HEK-293T בטמפרטורה של 37 °C וב-5% CO₂ במצע Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM) עם L-glutamine מיוצב, בתוספת 10% fetal calf serum (FCS), streptomycin (100 μg/ml) ו-penicillin (100 IU/ml). מעבירים את התאים (passage) באמצעות טריפסינציה כל 4-5 ימים ומדללים אותם ביחס של 1:10 לבקבוק חדש. התאים צריכים להיות בשלב הלוגריטמי (log phase) לצורך הניסויים.
2. ביום הניסוי, השכילו את התאים באמצעות טריפסינציה ובצעו ספירת תאים. השקיעו את התאים באמצעות סנטריפוגציה, ותלו אותם מחדש בריכוז של 3 x 10⁵ cells/ml במצע תרבית. קחו בחשבון שנדרשים 12.5 ml של תסספת תאים עבור כל פלטת סריקה.
3. שוב, תלו את התאים מחדש בריכוז של 3 x 10⁵ cells/ml במצע תרבית. קחו בחשבון שנדרשים 12.5 ml של תסספת תאים עבור כל פלטת סריקה.
4. אופציונלי: הוסיפו למצע התרבית uridine בריכוז של 20 μg/ml.
   הערה: בעת סריקת ספריות כימיות למציאת מעכבי רפליקציה ויראלית, נראה כי מבודדים לעיתים קרובות תרכובות המטרגטות שלבים מוקדמים של מסלול הביוסינתזה של פירימידין. הוספת uridine למצע התרבית משמשת לסינון של מולקולות אנטי-ויראליות כאלה. למעשה, פעולה זו מחזירה ביעילות את הרפליקציה הוויראלית כאשר אנזימים במעלה מסלול הביוסינתזה של פירימידין חסומים.
5. שמרו 1:10 מתסספת התאים עבור בארי הבקרה עם תאים שאינם מזוהמים, והמשיכו להדבקה עם הנפח הנותר.
6. הפשיתו את הנפח המתאים של תמיסת המלאי של rMV2/Luc. תמיסות מלאי של MV הן בדרך כלל בריכוז של 10⁶-10⁸ חלקיקים מדבקים למ"ל. יש להדביק את התרבית ב-0.1 חלקיקים מדביקים של rMV2/Luc לכל תא מטרה, מה שמתאים לריבוי הדבקה (MOI) של 0.1. 
   הערה: rMV2/Luc נגזר מחסון MV (זן Schwarz) ומטופל בסביבת BSL2.
7. הוסיפו את הנגיף לתסספת התאים וערבבו בעדינות. העבירו תאים מזוהמים לאמבטיה (trough), וחלקו 100 μl של תסספת תאים מזוהמים בעמודות 2 עד 11 של פלטות D2 המכילות תרכובות כימיות. יש לערבב בעדינות ובאופן קבוע את תסספת התאים בתוך האמבטיה.
8. בעמודות 1 ו-12, חלקו 100 μl של תאים שאינם מזוהמים לכל באר. תאים מזוהמים מחולקים בשאר הבאריים.
9. דגרו את התאים למשך 24 שעות בטמפרטורה של 37 °C וב-5% CO₂.

2. סריקה משנית לרעילות ופעילות אנטי-ויראלית רחבת-ספקטרום

1. בצעו מיהולים סדריים ביחס של 1:2 עבור כל תרכובת שהתגלתה (hit compound) בתוך dimethylsulfoxide (DMSO), החל מ-500 µM ועד 4 µM (8 מיהולים). מלאו פלטות תרבית רקמות לבנות עם ברקוד ב-50 µl של תרבית. הוסיפו 1 µl מכל מיהול של התרכובת לבארי תרבית. חזרו על הפעולה פעמיים כדי לקבל 3 פלטות תרבית עם מיהולים סדריים כפולים עבור כל תרכובת שהתגלתה.
2. הכינו 37.5 ml של תרחיף תאי HEK-293T בריכוז של 6 x 10⁵ תאים/ml בתוך תרבית, כפי שמתואר לעיל (בסעיפים 1.1 ו-1.2). חלקו 2x 12.5 ml לשפורי Falcon והדביקו את התאים עם rMV2/Luc ב-MOI = 0.1 או עם נגיף chikungunya רקומביננטי (CHIKV) המבטא Renilla luciferase (CHIKV/Ren) ב-MOI = 0.2. ערבבו באמצעות הפיכה.
   הערה: CHIKV/Ren נגזר מזן פראי של CHIKV ולכן יש לטפל בו בסביבת BSL3. ניתן להעביר את הפלטות מ-BSL3 ל-BSL1 לאחר הוספת סובסטרט Renilla לבארי התרבית (ראו להלן).
3. חלקו 50 µl של תאים שאינם מודבקים, תאים מודבקי rMV2/Luc, או תאים מודבקי CHIKV/Ren לפלטות תרבית המכילות מיהולים סדריים של התרכובות שהתגלו. הדגירו למשך 24 שעות ב-37 °C.
4. הוסיפו 50 µl של סובסטרט firefly luciferase כדי לקבוע את פעילות ה-firefly luciferase בבאריים המודבקים ב-rMV2/Luc. הוסיפו 50 µl של סובסטרט Renilla luciferase כדי לקבוע את פעילות ה-Renilla luciferase בבאריים המודבקים ב-CHIKV/Ren. לבסוף, הוסיפו 50 µl של ריאגנט לבדיקת חיוניות מבוססת לוסיפראז לתאים שאינם מודבקים כדי לקבוע את החיוניות התאית.
5. שרטטו את הנתונים (איור 1) וקבעו את ריכוזי התרכובות שהתגלו אשר מעכבים את השכפול של MV ו-CHIKV ב-50%. התעלמו מתרכובות המראות רעילות מסוימת בבדיקה זו.

תוצאות

איור 1. תגובה למינון של פעילות אנטי-ויראלית ורעילות של התרכובות C864, C648 ו-C062. (A) תאי HEK-293T הודבקו בזן rMV2/Luc של MV המבטא לוסיפראז (MOI=0.1), ודגרו עם מינונים עולים של C864, C648, C062 או DMSO בלבד. לאחר 24 שעות, נקבע ביטוי הלוסיפראז. * מציין כי עיכוב הלוסיפראז שנצפה היה מובהק סטטיסטית עבור שלוש התרכובות (p-values < 0.05). (B) תאי HEK-293T הודבקו בזן CHIKV/Ren של CHIKV המבטא Renilla luciferase (MOI=0.2), ודגרו עם מינונים עולים של C864, C648, C062 או DMSO בלבד. לאחר 24 שעות, נקבע ביטוי ה-Renilla luciferase. * מציין עיכובים מובהקים סטטיסטית עבור שלוש התרכובות (p-values < 0.05). (C) תאי HEK-293T דגרו עם מינונים עולים של C864, C648, C062 או DMSO בלבד. כביקורת לרעילות, לתלתים התאים הוספו 2.5 μl של תמיסת IGEPAL בריכוז 0.5%. לאחר 24 שעות, נקבע מספר התאים החיים באמצעות בדיקת חיוניות מבוססת לוסיפראז.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
פלטפורמת Freedom EVO	TECAN		פלטפורמה רובוטית
מיקרו-פלטות לבנות לתרבית תאים מ-96 בארות, פוליסטירן	Greiner Bio One	655083
CellTiter-Glo luminescent cell viability assay	Promega	G7570	בדיקת חיוניות תאים מבוססת לוציפראז
Bright-Glo luciferase assay system	Promega	E2610	ריאגנט המכיל סובסטרט ללוציפראז של גחליליות
Renilla-Glo luciferase assay system	Promega	E2710	ריאגנט המכיל סובסטרט ללוציפראז של Renilla
Britelite plus reporter gene assay system	Perkin-Elmer	6016761	ריאגנט המכיל סובסטרט ללוציפראז של גחליליות. יכול לשמש כחלופה לריאגנט Brigh-Glo לקביעת פעילות לוציפראז.