בידוד של וירוס ענק בודד מאוכלוסייה ויראלית מעורבת באמצעות אמב endlה

תקציר

מקור: Sahmi-Bounsiar, D. et al. מיקרו-שאיבה של תא בודד כאסטרטגיה חלופית למיון תאים מופעל פלואורסצנציה להפרדת תערובות של וירוסים ענקיים. J. Vis. Exp. (2019)

סרטון זה מדגים מיקרו-שאיבה של תא בודד (single-cell micro-aspiration) לצורך בידוד והרחבה של אוכלוסיית וירוס ענק בודדת מתוך אוכלוסייה נגיפית מעורבת, תוך שימוש באמבות כתאי מאכסן.

פרוטוקול

1. תרבית אמבה

1. השתמש ב-Vermamoeba vermiformis (זן CDC19) כתמיכה תאית.
2. הוסף 30 mL של מצע protease-peptone-yeast extract-glucose (PYG) (טבלה 1) ו-3 mL של האמבות בריכוז של 1 x 10⁶ תאים/mL לבקבוק תרבית תאים של 75 cm².
3. שמור את התרבית בטמפרטורה של 28 °C.
4. לאחר 48 שעות, כמת את האמבות באמצעות סליידים לספירה.
5. לשטיפה, קצור את התאים בריכוז של 1 x 10⁶ תאים/mL והשק את האמבות על ידי סרכזגציה ב-720 x g למשך 10 דקות. הסר את supernatant והשהה מחדש את המשקע בנפח המתאים של מצע הרעבה כדי להגיע לריכוז של 1 x 10⁶ תאים/mL (טבלה 1).

2. דילול נקודת קצה

1. בצעו דילול סדרתי (10^-1 עד 10^-11) של הדגימה הנגיפית במצע הרעבה (טבלה 1).
2. החדירו 100 µL מהתחליל למנות לכל צלחת פטרי המכילה 2 mL של 1 x 10⁶ Vermamoeba vermiformis.
3. הניחו את צלחות הפטרי בתוך שקית פלסטיק הניתנת לאטימה בטמפרטורה של 30 °C.
4. התחילו במעקב אחר צלחות הפטרי באמצעות מיקרוסקופ אור הפוך 6 שעות לאחר ההדבקה, ובדקו את מורפולוגיית התאים מדי 4 עד 8 שעות.
5. עם הופעת האפקט הציטופתית המתאפיין בעיגול התאים, התחילו בתהליך המיקרו-שאיבה של תא בודד.

3. מיקרו-שאיבה של תא בודד

1. הכנת המארח
   הערה: הכנה זו מיועדת לשחרור תאים בודדים נגועים למצע תאים טרי.
   1. טפל באמבאות בתרבית באמצעות סוכן אנטי-מיקרוביאלי המכיל 10 µg/mL של vancomycin, 10 µg/mL של imipenem, 20 µg/mL של ciprofloxacin, 20 µg/mL של doxycycline, ו-20 µg/mL של voriconazole. תערובת זו משמשת למניעת זיהום חיידקי ופטרייתי.
      הערה: ההליך מתבצע על שולחן עבודה מחוץ לתא הבטיחות המיקרוביולוגי. הוסף 2 mL של אמבאות בריכוז של 1 x 10⁶ תאים/mL לכל אחת מ-15 צלחות פטרי. לצורך היצמדות האמבאות, הדגר את התרבית ב-30 °C למשך 30 דקות.
2. בחר את צלחת הפטרי המשמשת למיקרו-שאיבה מתוך הדילול הגבולי בהתאם לקריטריונים הבאים: 1) היעדר כל זיהום נראה של פטריות וחיידקים, 2) עדות לאפקט ציטופתי של האמבאות עקב הנגיפים, ו-3) שלב פרה-ליזה ועיגול של האמבאות (כדי למנוע שאיבה של חלקיקי נגיף).
3. הקם עמדת עבודה עם החומרים הבאים (איור 1A,B): מיקרו-מניפולטור, המאפשר מיקום של מיקרו-קפילרה; מכשיר בקרה ידני ללחץ, המשמש לשאיבה ושחרור של התאים אל תוך המיקרו-קפילרה; מיקרוסקופ הפוך; מודולי מנוע מסוג Plug and play; מצלמה; מודול מחשב להדמיית המניפולציה וצילום תמונות.
4. בחר מיקרו-קפילרה (איור 1C).
   הערה: גודל התאים, העיוות וההיצמדות של ממברנותיהם למשטחים, והניידות התאית עשויים להשפיע על התקדמות חלקה של המיקרו-שאיבה. ניתן לבחור את קוטר המיקרו-קפילרה במדויק ולהתאימו לסוגי תאים ספציפיים בהתאם לגודלם ולשיטות השאיבה. מיקרו-קפילרה בעלת קוטר פנימי של 20 µm שימשה לשאיבת אמבה מעוגלת (קוטר ~10 µm). דבר זה מאפשר שמירה על מיקום פנימי ושחרור קל של התא.
5. הרכב את המערכת.
   1. קבע את זווית העבודה של מערכת התפיסה על המודול הממוטור ל-45°.
   2. בצע התקנה כפולה, תחילה על מערכת התפיסה ולאחר מכן על המיקרו-קפילרה.
   3. בצע פוקוס על התאים לאחר העברת מספר טיפות של שמן דרך המיקרו-קפילרה.
      הערה: שמן מינרלי בעל תאימות ביולוגית מסופק על ידי המכשיר.
   4. השלם את ההרכבה בהתאם להמלצות היצרן.
6. שיבוט תאים (איור 2A,B)
   1. הנח את צלחת הפטרי המכילה 2 mL של אמבאות נגועות תחת המיקרוסקופ.
   2. בצע פוקוס תחילה על התאים, ולאחר מכן על המיקרו-קפילרה הטבולה בתרבית.
   3. בחר תא בודד מעוגל וקרב את המיקרו-קפילרה באמצעות המיקרו-מניפולטור.
   4. הפעל שאיבה עדינה באמצעות בקרת לחץ ידנית על התא, והכנס אותו לתוך המיקרו-קפילרה. הוצא את התא הבודד מהדגימה הראשונה ושחרר אותו למצע התאים, ולאחר מכן הדגר אותו ב-30 °C.
   5. בצע תצפיות יומיות באמצעות מיקרוסקופ אופטי הפוך כדי לבחון את מראה התאים ולעקוב אחר הופעת האפקט הציטופתי.

טבלה 1: הרכב מצעי תרבית

תוצאות

איור 1: חומרים למיקרו-מניפולציה. (A) הגדרה בפועל של תחנת העבודה. (B) איור סכמתי של רכיבי תחנת העבודה. (C) איור סכמתי של המיקרו-קפילריה.

איור 2: שלבי מיקרו-שאיבה. (A) הליך בידוד תא בודד (תקריב x40). (B) איור סכמטי של השלבים השונים של שאיבת תא בודד: 1) איתור התא. 2) שאיבת התא. 3) שלב השחרור. החיצים השחורים מראים את המיקרו-קפילריה והלבנים מראים את התא הבודד.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
בקבוקי תרבית תאים של Corning, 150 סמ"ר²	Sigma-Aldrich	CLS430825	תרבית
בקבוקי תרבית תאים של Corning, 25 סמ"ק²	Sigma-aldrich	CLS430639	תרבית
בקבוקי תרבית תאים Corning 75 סמ"ר²	Sigma-Aldrich	CLS430641	תרבית
מצלמה DFC 425C	LEICA	לא ידוע	תצפית/ניטור
מיקרוסקופ הפוך Eclipse TE2000-S	Nikon	לא ידוע	תצפית/ניטור
מיקרוקפילריה 20 µm	Eppendorf	5175 107.004	מיקרו-שאיבה ושחרור של תאים
מיקרו-מניפולטור InjectMan NI2	Eppendorf	631-0210	מיקום מיקרו-קפילריה
צלחת פטרי 35 מ"מ	Ibidi	81158	תרבית/תצפית