מיון מבוסס פלואורסצנציה של חלקיקי וירוס בודדים לצורך אנליזה גנומית

תקציר

1. הכנת תרחיפי נגיפים לפני בידוד של ויריונים בודדים באמצעות ציטומטריה של זרימה, הכינו תרחיפי נגיפים שאינם מקובעים. בודדו חלקיקי נגיפים באמצעות פרוטוקולים שהוגדרו בעבר, תוך וידוא שהתרחיף הנגיפי הסופי נמצא ב-TE (Tris-EDTA, pH 8) מסונן ב-0.1 μm. אנו ממליצים להשתמש בגישות של סינון זרימה טנגנציאלי (TFF), אם כי פותחו שיטות אחרות המשתמשות בקוואגולציה כימית. ספרו את חלקיקי הנגיפים באמצעות פרוטוקולים מקובלים, לדוגמה באמצעות אפי-פלואורסנציה או ציטומטריה של זרימה. חלקו את התרחיף הנגיפי לשתי מבחנות Eppendorf (הנפח הסופי המומלץ הוא 1,000 μl). 2. ציטומטריה של זרימה כדי למיין נגיפים באמצעות ציטומטר זרימה BD FACSAria II המצויד ב-PMT לפיזור קדימה (FSC PMT) מותאם אישית, דללו חלקיקי נגיפים ב-TE מסונן ב-0.1 μm, pH 8.0, לטיטר מתאים לקצב אירועים של 200 אירועים לשנייה. הגדירו ספי (thresholds) כדי למקסם את יחסי אות לרעש; לדוגמה, עבור תערובת המכילה חלקיקי פאג T4 ולמבדה מומלצים הערכים הבאים: FSC PMT ב-1,000 ו-SSC ב-200. הריצו 100 μl של דגימות "בלנק" המכילות רק 1) TE מסונן ב-0.1 μm ו-2) TE מסונן ב-0.1 μm ו-SybrGreen1 בדילול של 1e-4 מהמלאי (10,000X). הריצו מנה קטנה (מומלץ 100 μl) של תרחיף נגיפים לא צבוע להערכת הרקע, ולאחריה את התרחיף הנגיפי הצבוע (SybrGreen1 בדילול של 1e-4 מהמלאי), עד לסך של 5,000 אירועים של חלקיקי נגיפים לכל דגימה. זאת כדי לבדוק את הריכוז ולהתאים את שערי המיון (sorting gates), במידת הצורך, לפני המיון. אנו ממליצים על שער צפוף במרכז חלקיקי הנגיפים. כמו כן, ליצירת השערים אנו משתמשים בגרף של SYBR Green ו-FSC PMT. הוסיפו 5 μl של אגרוז בנקודת התכה נמוכה (LMP) בריכוז 1% (בבופר TBE) שקולל ל-37 °C לכל באר על גשרירה של מיקרוסקופ מפוליטטרהפלואורואתילן (PTFE) (מבית Electron Microscopy Sciences). הכניסו את גשרירת ה-PTFE לתוך ציטומטר הזרימה כדי ללכוד את חלקיקי הנגיפים הממוינים. התחילו במיון של חלקיקי נגיפים הצבועים ב-SYBR green ישירות על גשרירת ה-PTFE עם LMP agarose. אנו ממליצים למיין 10 אירועים (חלקיקי נגיפים) או יותר בחלק מהבארים כדי לסייע בזיהוי עומק הנגיפים במהלך מיקרוסקופיית סריקה לייזר קונפוקלית (CSLM). עם סיום המיון, הוציאו את הגשרירה מציטומטר הזרימה והוסיפו 5 μl נוספים של LMP agarose שקולל ל-37 °C לכל באר, ובכך תקבעו את חלקיק הנגיף (או החלקיקים) בתוך הג'ל. זייגלר אלן, ל., ואח'. בידוד וניתוח גנומי של ויריונים בודדים באמצעות 'Single Virus Genomics'. .J. Vis. Exp. (2013).

סרטון זה מדגים כיצד פלואו-ציטומטריה מאפשרת בידוד של נגיפים בודדים המכילים גנום מאוכלוסיות מעורבות, באמצעות זיהוי מבוסס פלואורסצנציה ומיון מדויק של חלקיקים, ולאחר מכן קיבוע באגרוז לצורך אפיון גנומי עוקב.

פרוטוקול

1. הכנת תליות נגיפיות

לפני בידוד של ויריונים בודדים באמצעות ציטומטריה של זרימה, הכין תרחילי נגיפים שאינם מקובעים.

1. בודדו חלקיקי וירוס באמצעות פרוטוקולים שנקבעו בעבר, תוך וידוא שהסספנסיות הוויראלית הסופית נמצאת ב-TE (Tris-EDTA, pH 8) מסונן ב-0.1 μm. אנו ממליצים להשתמש בגישות של סינון זרימה טנגנציאלית (TFF), אם כי פותחו שיטות אחרות המשתמשות ב플וקולציה כימית.
2. ספרו את חלקיקי הווירוס באמצעות פרוטוקולים מקובלים, למשל באמצעות מיקרוסקופיה אפי-פלוורסצנטית 8-10 או ציטומטריית זרימה.
3. חלקו את הסספנסיה הוויראלית לאליקוטים בשתי מבחנות Eppendorf (הנפח הסופי המומלץ הוא 1,000 μl).

2. ציטומטריה של זרימה

1. כדי למיין וירוסים באמצעות מכשיר ה-BD FACSAria II Flow Cytometer המצויד ב-Forward Scatter PMT (FSC PMT) מותאם אישית, דללו חלקיקי וירוס ב-TE מסונן ב-0.1 μm, pH 8.0, לטיטר מתאים המאפשר קצב אירועים של 200 events sec^-1.
2. הגדירו ספי סף (thresholds) כדי למקסם את יחסי אות לרעש; לדוגמה, עבור תערובת המכילה חלקיקי פאג' T4 ולאמדא, מומלצים הערכים הבאים: FSC PMT ב-1,000 ו-SSC ב-200.
3. הריצו 100 μl של דגימות "בלנק" המכילות רק 1) TE מסונן ב-0.1 μm ו-2) TE מסונן ב-0.1 μm ו-SybrGreen1 בדילול של 1e-4 מהמלאי (10,000X).
4. הריצו אליקווט קטן (מומלץ 100 μl) של תרחיף וירוס לא צבוע כדי להעריך את הרקע, ולאחריו את תרחיף הווירוס הצבוע (SybrGreen1 בדילול של 1e-4 מהמלאי), עד לסך כולל של 5,000 אירועים עבור כל דגימה. זאת כדי לבדוק את הריכוז ולהתאים את שערי המיון (sorting gates), במידת הצורך, לפני המיון. אנו ממליצים על שער צפוף במרכז חלקיקי הווירוס. כמו כן, ליצירת השערים אנו משתמשים בתרשים של SYBR Green ו-FSC PMT.
5. הוסיפו 5 μl של 1% אגרוז בנקודת התכה נמוכה (LMP agarose) (בבופר TBE) שקוורר ל-37 °C לכל באער על גשמיט מיקרוסקופ מפוליטטרהפלואורואתילן (PTFE) (מבית Electron Microscopy Sciences).
6. הכניסו את גשמיט ה-PTFE למכשיר ה-flow cytometer כדי ללכוד את חלקיקי הווירוס הממוינים.
7. התחילו במיון של חלקיקי וירוס הצבועים ב-SYBR green ישירות על גשמיט ה-PTFE עם ה-LMP agarose. אנו ממליצים למיין 10 אירועים (חלקיקי וירוס) או יותר בכמה מהבאערים כדי לסייע בזיהוי עומקם של הווירוסים במהלך מיקרוסקופיית סריקה לייזר קונפוקלית (CSLM).
8. עם סיום המיון, הוציאו את הגשמיט מה-flow cytometer והוסיפו 5 μl נוספים של LMP agarose שקוורר ל-37 °C לכל באער, ובכך תקבעו את חלקיק(י) הווירוס במקומום.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
בופר TE בריכוז 1X	Invitrogen	12090-015
פנול רווי בבופר	Invitrogen	15513-039
אגרוז LMP (בעלת נקודת התכה נמוכה)	Invitrogen	16520100
זכוכית מיקרוסקופ PTFE	Electron Microscopy Sciences	63430-04	24 בארות, קוטר 4 מ"מ
βאגרגאז (Agarase)	New England Biolabs	M0392S