העשרה מבוססת אמבה של וירוסים ענקיים מדגימת מים סביבתית

תקציר

מקור: Bou Khalil, J. Y.,et al. אסטרטגיה מהירה לבידוד Faustoviruses חדשים מדגימות סביבתיות באמצעות Vermamoeba vermiformis. J. Vis. Exp. (2016)

סרטון זה מדגים העשרה של וירוסים ענקיים מדגימת מים סביבתית באמצעות תרבית משותפת (co-culture) מבוססת אמבה, כדי לאפשר זיהוי ואנליזה בשלבים הבאים.

פרוטוקול

1. איסוף דגימות

1. אספו 70 דגימות מסביבות ואזורים שונים. במקרה זה, השתמשו בבאים: 5 דגימות מים מזוהמים מהכפר Saint Pierre de Meyzoargues (צרפת), 15 דגימות מהאגם ב-Parc Borély במארסיי (צרפת); 15 דגימות מי ים עם משקעים מהמפרצים הסלעיים ב-Samena במארסיי (צרפת), 25 דגימות מי נהרות מהאלפים (צרפת), ולבסוף, 10 דגימות משפכים ב-La Ciotat (צרפת).
2. ערבבו את הדגימות ב-Vortex לצורך הומוגנציה לפני ההזחמה, למשך דקה אחת בטמפרטורת החדר ללא טיפול נוסף.

2. הליך בידוד

1. הכנת מאח עבור הליכי תרבית עיוורת והחדרת דגימות
   1. השתמש ב-Vermamoeba vermiformis (זן CDC19) כתמיכה תאית לתרבית משותפת.
   2. טפח את האמבות בטמפרטורה של 28 °C, בבקבוק תרבית תאים בנפח 75 cm² עם 30 ml של מצע protease-peptone-yeast extract-glucose (PYG). רכיבי ה-PYG מפורטים ב-טבלה 1.
      הערה: לאחר 48 שעות, כמות האמבות נקבעת באמצעות ספירה רגילה בעזרת סליידי ספירה (למשל, Kovaslides).
   3. אסוף את התאים בריכוז של 5 x 10⁵ עד 10⁶ תאים/מ"ל, ורכז את האמבות למשקע באמצעות סבוב במצנטריפוגה במהירות של 720 x g למשך 10 דקות.
   4. הסר את הנוזל העליון (supernatant) באמצעות שאיבה, ותלה את משקע האמבות מחדש ב-30 ml של תמיסת מלח סטרילית לאמבות מסוג Page's amoebal saline (PAS) לפי טבלה 1. חזור על הליך שטיפה זה.
   5. תלה את האמבות מחדש ב-30 ml של מצע הרעבה (starvation medium) עם תערובת אנטיביוטית ואנטי-פטרייתית בריכוז של כ-10⁶ אמבות/מ"ל. מצע ההרעבה הוא מצע הישרדות עבור האמבה, המאפשר לה להישאר בחיים ללא התכייסות (encystment) או התרבות. רכיבי המצע מפורטים ב-טבלה 1.
      הערה: תערובת הסוכנים האנטי-מיקרוביאליים הכילה 10 µg/ml vancomycin, 10 µg/ml imipenem, 20 µg/ml ciprofloxacin, 20 µg/ml doxycycline ו-20 µg/ml voriconazole. תערובת זו שימשה להפחתת זיהומים חיידקיים ופטרייתיים שעלולים להפחית או לשנות את השכפול הוויראלי.
   6. החדר באופן ישיר 25 µl מכל דגימה על שכבה אחת של אמבות (amoeba monolayer) בנפח 200 µl בלוחית 96-בארים בעלת תחתית שטוחה המעודדת היצמדות של האמבות, ודגור בטמפרטורה של 30 °C בסביבה לחה (סביבה לחה מושגת על ידי הנחת קומפרס רטוב בתוך השקית המכילה את הלוחית כדי למנוע התאיידות). זוהי תרבית הראשונית (primo-culture). השאר שתי בארות של אמבות ללא החדרת דגימות; אלו ישמשו כביקורת שלילית. דגור את התרבית הראשונית זו למשך שלושה ימים.
   7. שלושה ימים לאחר ההחדרה הראשונה, בצע תרבית משנית (sub-culture) של לוחית התרבית הראשונית על אמבות טריות כפי שתיאר לעיל, ללא תצפית מיקרוסקופית. דגור את הלוחית החדשה למשך שלושה ימים באותם תנאים של התרבית הראשונית.
   8. בצע את התרבית הסופית לאחר שלושה ימי דגירה אלו באותו אופן שבו בוצעו התרבית הראשונית והמשנית. דגור את התרבית הסופית למשך יומיים. לאחר מכן עבור לשלב הזיהוי.

טבלה 1. מתכוני תמיסות

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
מצע Protease-peptone-yeast extract-glucose (PYG), תמיסת Page's amoebal saline (PAS), מצע הרעבה (Starvation medium)	ייצור מעבדתי פנימי	Marseille URMITE	x
זן אמבה CDC-19	ATCC	France	50237
פלטות	Cellstar	France	655180
בקבוקים (Flasks)	SARSTEDT	Germany	833911
אולטרסנטריפוגה Sorval WX 80	Thermo scientific	France	9102448