כימות של נגיף הפטיטיס C זיהומי באמצעות מיקרוסקופיה פלואורסצנטית

תקציר

מקור: Ren, S., וכולםפרוטוקול לניתוח רבייה של נגיף הפטיטיס C. J. Vis. Exp. (2014)

סרטון זה מדגים את בדיקת מוקדי הפלואורסצנציה (fluorescence focus assay) המשמשת לכימות נגיפי Hepatitis C זיהומיים בתרבית תאים. הסרטון מדגים את הדילול הסידורי של העליון הנגיפי, את הדבקת תאי ההפטומה ואת זיהוי אתרי השכפול הנגיפי באמצעות מיקרוסקופיה פלואורסצנטית מבוססת נוגדנים.

פרוטוקול

1. מדידת טר הנגיף

1. זרע תאי Huh-7.5.1 נאיביים בריכוז של כ-3 x 10³ תאים לבאר באמצעות פלטה בעלת 96 בארות. למחרת, בצעו דילולים סדרתיים פי 10 של עליון תרבית נטול תאים שהופק מתאים שעברו טרנספקציה של RNA של נגיף צהבת C (HCV), באמצעות מצע גידול, והחדירו בשלוש חזרות לתאי Huh-7.5.1.
2. קבע את התאים 72 שעות לאחר ההדבקה באמצעות מתנול (למשך 30 דקות ב-20°C-) ºג) ובצע צביעה אימונוהיסטוכימית לחלבון HCV NS5A.
3. שטפו את התאים ב-PBS שלוש פעמים וחסמו באמצעות באפר חסימה ל-IFA.
4. השתמשו בנוגדן ראשוני פוליקלונלי של ארנב נגד NS5A או בנוגדן מונוקלונלי של עכבר נגד dsRNA מסוג J2 בדילול של 1:200 (1 μg/ml) והדגירה תימשך 5 שעות עד ללילה במטמפטורה של 4 ºג.
5. שטוף את התאים עם PBS שלוש פעמים לאחר השלב של הנוגדן הראשוני.
6. הוסף נוגדן שני פוליקלונלי מסוג goat anti-rabbit IgG-488 או נוגדן שני פוליקלונלי מסוג goat anti-mouse IgG-594 בדילול של 1:1,000 (1 μg/mlוהדגירה תימשך שעה אחת בטמפרטורת החדר.
7. שטוף את התאים ב-PBS שלוש פעמים והצג באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי
8. השתמשו בדילול הגבוה ביותר כדי לספור את המוקדים (foci) החיוביים ל-NS5A וחשבו את המספר הממוצע של יחידות יוצרות מוקדים (FFU) למיליליטר. ראו איור 1 עבור טיטר של HCV.

תוצאות

איור 1. בחינת זבניות ההדבקה של HCV מסוג בר ומדידת טר הנגיף. A) תאי Huh-7.5.1 נאיביים שימשו למחקרי הדבקה. העלייה נטולת התאים שנאספה 48 ו-96 שעות לאחר טרנספקציה (hpt) של RNA של HCV הועמדה לדילול סדרתי פי 10 והתווספה לתאים בלוחית 96-בארים בשלוש חזרות. 72 שעות לאחר ההדבקה, התאים קובעו ונצבעו אימונו-היסטוכימית עבור חלבון HCV NS5A. תאים עם צביעה חיובית ל-NS5A (אדום) הודבקו בנגיף. להערכת יחידות יוצרות מוקדים (FFU), נספרו המוקדים החיוביים בדילול הגבוה ביותר. מוצגים פנלים מייצגים של תמונות (סרגל קנה מידה 100 μm). B) ערכי ממוצע וסטיות תקן של טר נגיפי ביחידות FFU למילליטר מוצגים בגרף. המוטנט עם ביטול הפולימראז לא ייצר חלקיקים מדביקים. WT: סוג בר; Pol-: ביטול פולימראז.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
מצע דאלבקו המוגמר של איגל (DMEM)	Fisher Scientific	10-017-CV
Huh-7.5.1	The Scripps Research Institute		קו התאים סופק באדיבות על ידי ד"ר Francis Chisari לד"ר Arumugaswami במסגרת MTA חתום בין The Scripps Research Institute לבין Cedars-Sinai Medical Center
נוגדן מונוקלונלי לעכביש anti-dsRNA J2 מעכבר	אנגלית & Scientific Consulting Kft.	10010200
נוגדן משני פוליקלונלי מעז przeciw ל-IgG של ארנב Alexa Fluor 488	Life Technologies	A11008
נוגדן משני פוליקלונלי מעז przeciw ל-IgG של ארנב Alexa Fluor 594	Life Technologies	A11020