ויזואליזציה של דיכוי שעתוק בתאים נגועים בנגיף

תקציר

מקור: Kalveram, B. et al. שימוש בכימיית קליק למדידת השפעת זיהום נגיפי על סינתזת RNA של תא המאחסן. J. Vis. Exp. (2013)

סרטון זה מדגים את השימוש בכימיית קליק (click chemistry) ובמיקרוסקופיית פלואורסצנציה כדי להדמיות של שעתוק RNA ראשוני (nascent RNA) בתאי יונקים. הוא מדגיש כיצד זיהום נגיפי מדכא את השעתוק של תא המאחס באמצעות השוואת אותות פלואורסצנציה בין תאים מזוהמים לתאי ביקורת.

פרוטוקול

1. הדבקת תאים עם נגיף מחלה של עמק הריפט (RVFV) זן MP-12 וסימון RNA נבט (nascent RNA) באמצעות 5-ethynyl uridine (EU)

   1. זריעת תאי כליה עובריים אנושיים 293 (HEK293) לתוך פלטת תרבית רקמות בעלת 6 בארות במצע גידול (Dulbecco’s modified Eagle medium (DMEM) המכיל 10% fetal bovine serum, 100 U/mL penicillin, 100 μg/mL streptomycin). דגירה באינקובטור לח במעמדות של 37 °C ו-5% CO₂ עד שהתאים מגיעים ל-80% - 100% התמזגות (confluency).
   2. הדבקת התאים עם MP-12 בריבוי הדבקה (MOI) של 3. יש לכלול לפחות שתי בארות שאינן מודבקות: אחת מהן תשמש כביקורת לא-מודבקת, והשנייה תטופל ב-actinomycin D (ActD). יש להסיר את מצע הגידול ולדלל את מלאי הנגיף כך שהנפח הכולל המתווסף לכל בארה יהיה 400 μL. דגירה למשך שעה אחת באינקובטור לח ב-37 °C ו-5% CO₂.
   3. הסרת האינוקולום והוספת 2 mL מצע גידול טרי לכל בארה. דגירה ב-37 °C למשך 12 שעות.

   הערה: אם מתאימים פרוטוקול זה לשימוש עם נגיף אחר, מומלץ לבצע ניסוי של סדרת זמנים (time course) כדי לקבוע את נקודת הזמן האופטימלית לסימון ולאסוף את התאים. יש לתכנן את סדרת הזמנים כך שמועדי ההדבקה יהיו מדורגים, כדי שניתן יהיה לסמן, לאסוף ולצבוע את כל הדגימות בו-זמנית.

   4. 12 שעות לאחר ההדבקה (hpi), יש להחליף את מצע הגידול במצע המכיל 0.5 mM EU. לאחת הבארות שעברו הדבקה מדומה (mock-infected), יש להוסיף גם 5 μg/mL ActD. בארה זו תשמש כביקורת לדיכוי תעתוק, שכן ActD מעכב סינתזה של RNA התלויה ב-DNA. החזרת התאים לאינקובטור.
   5. ב-13 hpi, שטיפת התאים פעם אחת עם phosphate-buffered saline (PBS) ואיסופם על ידי טריפסינציה. שטיפת התאים שנאספו שלוש פעמים עם PBS המכיל 1 mM ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA).

   הערה: במהלך שלב זה ובשלבים הבאים, אין לסבב את התאים בצנטריפוגה במהירות העולה על 500-1,000 x g כדי למנוע שבירה של התאים. סבב את התאים בצנטריפוגה למשך 1-2 דקות להשקעה.

   הערה: אם מתוכנן ביצוע צביעה אימונו-ציטוכימית של פני השטח לאחר תגובת ה-click, יש לאסוף את התאים באמצעות rubber policeman או גורד תאים חד-פעמי במקום.

   6. קיבוע התאים על ידי תלייתם מחדש ב-1 mL של 4% paraformaldehyde (PFA) ודגירה למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר (RT).
   7. שטיפה אחת עם 1 mL PBS-EDTA לכל בארה. מעבר מיידי לשלב 2.

   הערה: חשוב להתחיל מיד בתגובת ה-click, מכיוון שה-RNA נחלש אם נשמר בשלב זה לפרקי זמן ממושכים. באופן דומה, בעת ביצוע ניסוי של סדרת זמנים, יש לוודא שכל הדגימות מסומנות, מקובעות ונצבעות בו-זמנית.

2. תגובת Click לזיהוי RNA מסומן

   1. הגשמת התאים (Permeabilization) על ידי הוספת 1 ml של 0.2% Triton X-100 ב-PBS. דגירה למשך 10 דקות ב-RT.

   הערה: כל התמיסות המשמשות בשלבים 2.1 עד 2.3 חייבות להיות נקיות מנוקלאזים (nuclease free).

   2. שטיפה שלוש פעמים עם 1 ml PBS לכל בארה.
   3. הסרת כיסויי הזכוכית (coverslips) מפלטה של 12 בארות והעברתם לתא לח. כיסוי כל כיסוי זכוכית ב-50 - 100 μl של תמיסת צביעת click (המכילה 100 mM Tris pH 8.5, 1 mM CuSO₄, 20 μM fluorescent azide [שיא עירור/פליטה: 590/617 nm], 100 mM ascorbic acid). דגירה למשך שעה אחת ב-RT בחושך.

   הערה: להרכבת התא הלח, יש לרפד את תחתיתה של צלחת תרבית תאים או צלחת פטרי בקוטר 10 ס"מ בסרט פאראפין פלסטי. יש לרפד את החלק הפנימי של דופן הצלחת במגבונים נייר לחים. הנחת כיסויי הזכוכית על סרט הפאראפין הפלסטי.

   הערה: יש להיזהר שלא לאפשר לכיסויי הזכוכית להתייבש במהלך שלב זה או בכל שלב אחר בפרוטוקול. מומלץ להוסיף את תמיסת הצביעה לכל כיסוי זכוכית מיד לאחר הנחתו בתא הלח.

   הערה: יש להכין את תמיסת צביעת ה-click באופן טרי מיד לפני שלב זה. ניתן לאחסן תמיסות מלאי של 1.5 M Tris pH 8.5, 100 mM CuSO₄, ו-500 mM ascorbic acid ב-4 °C. עם זאת, יש להשליך כל תמיסת מלאי של ascorbic acid שהפכה לצהובה.

   הערה: יש לוודא בחירת פלואורופור התואם למסננים במיקרוסקופ הפלואורסצנציה שלך.

   4. הסרת כיסויי הזכוכית מהתא הלח והנחתם בפלטת 12 בארות נקייה, ושטיפתם שלוש פעמים עם 1 ml PBS לכל בארה.
   5. העמדת כיסויי הזכוכית על ידי הנחת טיפה אחת (כ-15 μl) של Fluoromount-G על זכוכית מיקרוסקופ. טבילת כיסוי הזכוכית ב-H₂O, הסרת עודפי H₂O על ידי נגיעה בצד של מגבת נייר, והנחת התאים כשהם פונים כלפי מטה לתוך טיפת ה-Fluoromount-G. ייבוש באוויר למשך 5 דקות.

   הערה: אם מדובר בדימות במיקרוסקופ הפוך, יש לאפשר ל-Fluoromount-G להתמצק ב-4 °C למשך לילה, או להצמיד את כיסויי הזכוכית לזכוכית המיקרוסקופ על ידי איטום השוליים בלק שקוף.

   הערה: ניתן לדמות את הזכוכית מיד או לאחסנה ב-4 °C בחושך למשך עד שבוע.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
5-Ethynyl uridine	Berry Associates	PY 7563	המס ב-DMSO לתמיסת מלאי בריכוז 100 mM
לוחית כיסוי עגולה 12-mm	Fisherbrand	12-545-82
Actinomycin D (ActD)	Sigma	9415	המס ב-DMSO לתמיסת מלאי בריכוז 10 mM
מיקרוסקופ פלואורסצנציה			למשל Olympus IX71
CuSO₄	Sigma	C-8027	המס ב-H₂O לתמיסת מלאי בריכוז 100 mM
DMEM (Dulbecco's modified eagle medium)	Invitrogen	11965092
FBS (Foetal bovine serum)	Invitrogen	16000044
אזיד פלואורסצנטי (מצומד ל-Alexa Fluor 594)	Invitrogen	A10270
Fluoromount-G	Southern Biotech	0100-01
L-ascorbic acid	Sigma	A-5960	המס ב-H₂O לריכוז 500 mM
Paraformaldehyde	Sigma	158127
Penicillin-Streptomycin	Invitrogen	15140122
Triton X-100	Sigma	T-8787
Trypsin-EDTA	Invitrogen	25200056
Trizma base	Sigma	T-1503	המס ב-H₂O לתמיסת מלאי בריכוז 1.5 M, pH 8.5