ניתוח של דיכוי תמלול של תא מאכסן המושרה על ידי נגיף באמצעות ציטומטריה עם זרימה

תקציר

מקור: Kalveram, B., et al. שימוש בכימיית קליק למדידת השפעת זיהום נגיפי על סינתזת RNA בתא המאכסן. J. Vis. Exp. (2013)

סרטון זה מדגים את השימוש בכימיית קליק (click chemistry) ובציטומטריה של זרימה כדי למדוד דיכוי של שעתוק בתאי מאחס המושרה על ידי נגיף. תאי יונקים מודבקים בנגיף המבטא חלבון ארגס (virulence protein) גרעיני המשבש את קומפלקס גורמי השעתוק של המאחס, בעוד שתאי בקרה נשארים פעילים מבחינת שעתוק. שילוב של 5-ethynyl uridine מסמן mRNA שסונתז לאחרונה, מה שמאפשר כימות של הפעילות השעתוקית בתאים מודבקים ובתאי בקרה באמצעות זיהוי פלואורסצנציה כפולה.

פרוטוקול

1. הדבקת תאים ב-MP-12 וסימון RNA ראשוני באמצעות 5-ethynyluridine (EU)

1. זרוע תאי 293 לפלטת תרבית רקמה בעלת 6 בארות במצע גידול (DMEM המכיל 10% fetal bovine serum, 100 U/ml Penicillin, 100 μg/ml Streptomycin). דגור באינקובטור לח בטמפרטורה של 37 °C ו-5% CO₂ עד שהתאים יגיעו ל-80 - 100% התמסגרות (confluency).
2. הדבק את התאים ב-MP-12 ב-m.o.i. של 3. הכלל לפחות שתי בארות לא מודבקות: אחת משתי הבארות תשמש כביקורת לא מודבקת, והשנייה תטופל ב-ActD בשלב 1.4. הסר את מצע הגידול ודלל את מלאי הווירוס כך שהנפח הכולל שנוסף לכל בארה יהיה 400 μl. דגור למשך שעה אחת באינקובטור לח בטמפרטורה של 37 °C ו-5% CO₂.
3. הסר את האינוקולום והוסף 2 ml מצע גידול טרי לכל בארה. דגור ב-37 °C למשך 12 שעות.

הערה: במידה ומסייעים פרוטוקול זה לשימוש עם נגיף אחר, מומלץ לבצע ניסוי של סדרת זמנים כדי לקבוע את נקודת הזמן האופטימלית לסימון ולאיסוף. הגדירו את סדרת הזמנים כך שזמני ההדבקה יהיו מדורגים, כדי שניתן יהיה לסמן, לאסוף ולצבוע את כל הדגימות בו-זמנית.

4. בשעה ה-12 לאחר ההדבקה (h.p.i.), החליפו את מצע הגידול במצע המכיל 0.5 mM EU. לאחת מהבארים שסמנו כהדבקה דמה (mock infected), הוסיפו גם 5 μg/ml ActD. פעולה זו תשמש כביקורת לדיכוי תעתוק, מכיוון ש-ActD מעכב סינתזה של RNA התלויה ב-DNA. החזירו את התאים לאינקובטור.
5. בשעה ה-13 לאחר ההדבקה (h.p.i.), שטפו את התאים פעם אחת עם PBS ואספו אותם באמצעות טריפסינזציה של התאים. שטפו את התאים שנאספו שלוש פעמים עם PBS המכיל 1 mM EDTA (PBS-EDTA).

הערה: במהלך שלב זה ובשלבים הבאים, אין לסובב את התאים בצנטריפוגה במהירות העולה על 500 - 1,000 x g כדי למנוע פירוק של התאים. סובב את התאים בצנטריפוגה למשך 1-2 דקות לצורך שיקוע.

הערה: אם מתוכנן ביצוע צביעה אימונוציטוכמית של פני השטח לאחר תגובת ה-click, יש לאסוף את התאים באמצעות rubber policeman או מגרדת תאים חד-פעמית במקום זאת.

6. קבעו את התאים על ידי ריסוס מחדש של התאים ב-1 ml של 4% PFA והדגירה למשך 30 min ב-RT.
7. שטפו פעם אחת עם 1 ml PBS-EDTA לכל באר. המשיכו מיד לשלב 6.

הערה: חשוב להמשיך באופן מיידי לתגובת ה-click, שכן ה-RNA מתפרק אם נשמר בשלב זה למשך פרקי זמן ממושכים. באופן דומה, בביצוע ניסוי של סדרת זמנים (time course), יש לוודא את סימון, קיבוע וצביעת כל הדגימות בו-זמנית.

2. תגובת קליק לזיהוי RNA מסומן

1. בצעו פרמיליזציה לתאים על ידי השהייה מחדש ב-0.5 ml של 0.2% Triton X-100 ב-PBS. דגרו למשך 10 min ב-RT.

הערה: כל התמיסות המשמשות בשלבים 2.1 עד 2.3 חייבות להיות נקיות מנוקליאז. אם התאים אינם שוקעים כראוי במהלך שלב זה, יש להגדיל את זמן הצנטריפוגה ל-5 min. התנהגות השקיעה תשתפר ברגע שהתאים יסuspended בבופר FACS.

2. שטוף פעם אחת עם 1 מ"ל PBS.

הערה: אין להשתמש ב-EDTA בשלב זה, כיוון שחומר זה יקשור (chelate) את יוני ה-Cu²⁺ הדרושים לתגובת ה-click.

3. שספנדו את התאים ב-200 μl של תמיסת צביעה לקליק (100 mM Tris pH 8.5, 1 mM CuSO4, 200nM azide המסומן בצבע פלואורסצנטי [שיא עירור/פליטה: 650/665 nm], 100 mM ascorbic acid). הדגירו למשך שעה אחת בטמפרטורת החדר (RT) בחשכה.

הערה: הכינו את תמיסת צביעת ה-click באופן טרי מיד לפני שלב זה. ניתן לשמור תמיסות מלאי של 1.5 M Tris pH 8.5, 100 mM CuSO₄, ו-500 mM ascorbic acid בטמפרטורה של 4 °C. עם זאת, השליכו כל תמיסת מלאי של ascorbic acid שהפכה לצהובה. אם התאים נצמדים זה לזה במהלך שלב זה, השהו אותם מחדש על ידי פיפטינג למעלה ולמטה מספר פעמים. ודאו שאתם בוחרים פלואורופור שניתן לזיהוי באמצעות סייטומטר הזרימה שלכם. כמו כן, הכינו דגימה אחת של תאים נגועים שאינם עוברים את הליך צביעת ה-click; אלה יידרשו לצורך כיול של סייטומטר הזרימה. השתמשו במחצית מהתאים הנגועים או הוסיפו באר נגועה נוספת בשלב 1.2.

שטפו פעמיים עם FACS buffer (PBS המכיל 1 mM EDTA ו-0.5% (w/v) BSA).

3. אימונופלואורסצנציה לזיהוי ביטוי של חלבונים ויראליים

1. ששב את התאים ב-200 μl של נוגדן ראשוני (anti-RVFV) המדולל ב-FACS buffer (יחס של 1:10,000) והדגר למשך שעה אחת בטמפרטורת החדר (RT) בחושך.

הערה: לחלופין, ניתן לבצע שלב זה במהלך הלילה (O/N) בטמפרטורה של 4 °C בחשיכה.

הערה: הכינו גם דגימה אחת של תאים שאינם מודבקים שעברו את הליך הצביעה בשיטת ה-click אך לא יעברו צביעה אימונוגנית; אלו יהיו דרושים לצילוב (כיול) של ציטומטר הזרימה. השתמשו בחצי מכמות התאים שעברו הדבקה מדומית (mock infected) או הוסיפו באר נוספת של תאים שאינם מודבקים בשלב 1.2.

הערה: בעת התאמת פרוטוקול זה לשימוש עם נגיף אחר, קבעו תחילה את הדילול האופטימלי עבור הנוגדן הראשוני שלכם.

2. שטוף את התאים פעמיים בבופר FACS.
3. השהה מחדש את התאים ב-200 μl של נוגדן משני (anti-mouse IgG המצומד לצבע פלואורסצנטי [שיא עירור/פליטה: 495/519 nm]) המדולל בבופר FACS (1:1,000) והדגר למשך שעה אחת בטמפרטורת החדר (RT) בחושך.
4. שטוף את התאים פעם אחת בבופר FACS.

הערה: בשלב זה, ניתן לשמור את התאים למשך לילה (O/N) בטמפרטורה של 4 °C בחושך.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
5-ethynyl-uridine	Berry Associates	PY 7563	להמיס ב-DMSO לתמיסת מלאי של 100 mM
כיסויות עגולות 12-mm	Fisherbrand	12-545-82
מבחנות פוליסטירן 5 ml	BD Biosciences	352058
Actinomycin D (ActD)	Sigma	9415	להמיס ב-DMSO לתמיסת מלאי של 10 mM
Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG	Invitrogen	A-11029
Bovine Serum Albumin (BSA)	Santa Cruz	sc-2323
CuSO₄	Sigma	C-8027	להמיס ב-H2O לתמיסת מלאי של 100 mM
DAPI	Sigma	D-9542	להמיס ב-H2O לתמיסת מלאי של 5 mg/ml
DMEM	Invitrogen	11965092
FBS	Invitrogen	16000044
אזיד פלואורסצנטי (מצומד ל-Alexa Fluor 594)	Invitrogen	A10270
אזיד פלואורסצנטי (מצומד ל-Alexa Fluor 657)	Invitrogen	A10277
Fluoromount-G	Southern Biotech	0100-01
L-ascorbic acid	Sigma	A-5960	להמיס ב-H2O לריכוז של 500 mM
מסנן נייר	VWRbrand	28333-087
paraformaldehyde	Sigma	158127
Penicillin-Streptomycin	Invitrogen	15140122
poly-L-lysine (MW ≥ 70000)	Sigma	P1274
Triton X-100	Sigma	T-8787
Trizma base	Sigma	T-1503	להמיס ב-H2O לתמיסת מלאי של 1.5 M, pH 8.5
Trypsin-EDTA	Invitrogen	25200056
מיקרוסקופ פלואורסצנציה			למשל Olympus IX71
ציטומטר זרימה			למשל BD Biosciences LSRII Fortessa