ייצור חלקיקי רטרו-וירוס להעברת גנים

תקציר

מקור: .Zjablovskaja, P הנח תרחיף של תא בודד של תאי Bosc23 (מספר $6 \times 10^6$) בצלחת פטרי בקוטר 16 ס"מ וטפח ב-18 מ"ל של DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium) המכיל 10% FBS (סרום בקר עוברי) עד שהצפיפות (confluency) של התרבית תגיע ל-80% (24 שעות). הערה: התאים צריכים לגדול כשכבה אחת (monolayer) ולא ליצור גושים בתרבית. ניתן לבצע ספירת תאים בשיטות שונות (תקף עבור שאר הפרוטוקולים המוצגים כאן). במקרה של מספר דגימות נמוך, מומלץ לבצע ספירה ידנית תחת מיקרוסקופ באמצעות תא Bürker. במקרה זה, השתמש ב-Trypan blue לשלילת תאים מתים. ערבב את התאים ביחס של 1:1 עם Trypan Blue בריכוז 0.4% ב-PBS (סליין עם בופר פוספט). לצורך ספירה של מספר רב של דגימות, ניתן להשתמש בסופר תאים אוטומטי. שלב 40 $\mu \text{g}$ של קונסטרוקט רטרו-ויראלי (כגון MSCV), 20 $\mu \text{g}$ של pCL-Eco (וקטור אריזה), 80 $\mu \text{l}$ של PEI (polyethylenimine), ו-2 מ"ל של מצע עם סרום מופחת (למשל, Opti-MEM (Minimum Essential Medium)) ללא אנטיביוטיקה. דגור תערובת זו למשך 20 דקות בטמפרטורת החדר (RT). החל בזהירות את מצע תאי ה-Bosc23 ב-16 מ"ל DMEM בתוספת 2% FBS. חמם מראש את המצע ל-37 °C לפני השימוש. הערה: אין להשתמש באנטיביוטיקה במהלך הטרנספקציה, שכן היא עלולה להפחית את יעילות הטרנספקציה. הוסף את התערובת שהוכנה בסעיף 1.2 בטיפות ובזהירות לתוך תרבית ה-Bosc23, ודגור למשך 4 שעות ב-37 °C. הגבל את הדגירה לפחות מ-6 שעות בשל רעילות ה-PEI. לאחר הדגירה, החלף את מצע ה-Bosc23 ל-18 מ"ל DMEM שחומם מראש ומכיל 10% FBS, וטפח את התאים למשך 48 שעות ב-37 °C. הנח את הצלחות הפטרי במעבדה ברמת בטיחות ביולוגית 2 (biosafety level 2), ופעל לפי נהלי בטיחות סטנדרטיים. אסוף את מצע ה-Bosc23 (המכיל חלקיקי רטרו-וירוס אקוטרופיים) באמצעות פיפטה סרולוגית של 25 מ"ל לתוך מבחנה קונית של 50 מ"ל, ואחסן ב-4 °C. הערה: (חשוב) יעילות הטרנספקציה צריכה להגיע ל-90% כדי לייצר וירוס בתר (titer) גבוה. הוסף 18 מ"ל DMEM 10% FBS שחומם מראש לתאי Bosc23 וטפח למשך 24 שעות. חזור על שלב 1.6. הערה: ניתן לאחד על-נוזלים (supernatants) רטרו-ויראליים משלבים 1.6 ו-1.8 ברגע שיגיעו לאותה טמפרטורה (4 °C) כדי לשמר את השלמות הויראלית. כדי למנוע זיהום של תאי Bosc23 בעל-נוזלים ויראליים, סבב את הווירוס שנאסף ב-1500 $\times \text{g}$ למשך 10 דקות ב-4 °C. חלק את הווירוס לאליקוטים (aliquots), הקפא במהירות באמצעות קרח יבש או חנקן נוזלי, ואחסן ב-80- °C. עם זאת, שים לב כי וירוס שהוכן טרי הוא באיכות גבוהה יותר מבחינת יעילות ההדבקה מאשר מאגרים קפואים. הערה: (חשוב) הימנע מהקפאה והפשרה חוזרת של הווירוס, שכן הדבר מוביל לדגראדציה ויראלית.שגשוג והתמיינות של תאי אב מיאלואידיים עכבריים מסוג 32D/G-CSF-R. .J. Vis. Exp (2018)

סרטון זה מדגים את ייצורן של חלקיקים רטרו-ויראליים רקומביננטיים על ידי טרנספקציה של תאי אריזה שמקורם בכליה אנושית, מה שמאפשר העברה יציבה של גנים לתאי מטרה עבור יישומים המשכיים כגון שינוי גנטי, בדיקות תפקודיות או מחקרי בידול של שושלות תאים.

פרוטוקול

1. הפקת רטרו-וירוס
   1. זרוע תרחיף תאים בודדים של תאי Bosc23 ‏(6 × 10⁶) בצלחת פטרי בקוטר 16 cm וטפח ב-18 mL של DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium) המכיל 10% FBS (סרום בקר עוברי) עד שהצפיפות (confluency) של התרבית תגיע ל-80% (24 שעות).
      הערה: התאים צריכים לגדול כשכבה אחת (monolayer) ולא ליצור גושים בתרבית. ניתן לבצע ספירת תאים בשיטות שונות (תקף לשאר הפרוטוקולים המוצגים כאן). במקרה של מספר דגימות נמוך, מומלץ לבצע ספירה ידנית תחת מיקרוסקופ באמצעות תא בורקר (Bürker chamber). במקרה זה, השתמש ב-Trypan blue להדרה של תאים מתים. ערבב תאים ביחס של 1:1 עם 0.4% Trypan Blue ב-PBS (מלח פוספט רב-ערכי). לצורך ספירה של מספר רב של דגימות, ניתן להשתמש בסופר תאים אוטומטי.
   2. שלב 40 µg של מבנה רטרו-ויראלי (כגון MSCV), ‏20 µg של pCL-Eco (וקטור אריזה), ‏80 µl של PEI (polyethylenimine) ו-2 mL של מצע עם סרום מופחת (למשל, Opti-MEM (Minimum Essential Medium)) (ללא אנטיביוטיקה). הדגר תערובת זו למשך 20 דקות בטמפרטורת החדר (RT).
   3. החלף בזהירות את מצע תאי ה-Bosc23 ב-16 mL DMEM המועשיר ב-2% FBS. חמם מראש את המצע ל-37 °C לפני השימוש.
      הערה: אין להשתמש באנטיביוטיקה במהלך הטרנספקציה, שכן היא עלולה להפחית את יעילות הטרנספקציה.
   4. הוסף את התערובת שהוכנה בשלב 1.2 בטיפות ובזהירות לתרבית ה-Bosc23, והדגר למשך 4 שעות ב-37 °C. הגבל את ההדגרה לפחות מ-6 שעות בשל רעילות ה-PEI.
   5. לאחר ההדגרה, החלף את מצע ה-Bosc23 ל-18 mL DMEM שחומם מראש ומכיל 10% FBS, וטפח את התאים למשך 48 שעות ב-37 °C. הנח את הצלחות הפטרי במעבדה ברמת בטיחות ביולוגית 2 (BSL-2), ופעל לפי נהלי הבטיחות הסטנדרטיים.
   6. אסוף את מצע ה-Bosc23 (המכיל חלקיקים רטרו-ויראליים אקוטרופיים) באמצעות פיפט סרולוגית של 25-mL לתוך מבחנה קונית של 50-mL, ואחסן ב-4 °C.
      הערה: (חשוב) יעילות הטרנספקציה צריכה להגיע ל-90% כדי להפיק וירוס בטר (titer) גבוה.
   7. הוסף 18 mL DMEM 10% FBS שחומם מראש לתאי Bosc23 וטפח למשך 24 שעות.
   8. חזור על שלב 1.6.
      הערה: ניתן לאחד על-נוזלים (supernatants) רטרו-ויראליים משלבים 1.6 ו-1.8 ברגע שהם מגיעים לאותה טמפרטורה (4 °C) כדי לשמור על השלמות הוויראלית.
   9. כדי למנוע זיהום של תאי Bosc23 בעל-נוזלים ויראליים, סבב את הווירוס שנאסף ב-1500 × g למשך 10 דקות ב-4 °C. חלק את הווירוס לאליקוטים, הקפא במהירות (snap freeze) באמצעות קרח יבש או חנקן נוזלי, ואחסן ב-80 °C-. עם זאת, שים לב שווירוס שהוכן טרי הוא באיכות גבוהה יותר מבחינת יעילות ההדבקה מאשר מאגרים קפואים.
      הערה: (חשוב) הימנע מהקפאה והפשרה חוזרת של הווירוס, שכן הדבר מוביל לפירוק ויראלי.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium)	Thermo Fisher Scientific, וולת'אם, מסצ'וסטס, ארה"ב	15028
Opti-MEM ((Minimum Essential Medium) - מצע עם ריכוז סרום מופחת	Thermo Fisher Scientific, וולת'אם, מסצ'וסטס, ארה"ב	31985-047	L-גלוטמין, פנול אדום
סרום בקר עוברי (FBS)	Thermo Fisher Scientific, וולת'אם, מסצ'וסטס, ארה"ב	10270	משמש לתרבית תאי HEK293T, NIH3T3, BOSC23
פניצילין	Sigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, USA)	P3032
סטרפטומייסין	Sigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, USA)	S9137	אבקת מלח סטרפטומיצין סולפיה
גנטמיצין	Sigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, USA)	G1914
פוליאתילנאימין	Polyscience, וורינגטון, פנסילבניה, ארה"ב	23966	ליניארי, משקל מולקולרי 25,000 (PEI 25000)