הפקה של נגיף סינציטיאלי נשימתי (RSV) רקומביננטי המסומן ב-GFP באמצעות מערכת ביטוי T7

תקציר

מקור: בוליאר, C. ואחרים., הגברה ותיתור של נגיפי סינציטיום נשימתי (RSV) רקומביננטיים. .J. Vis. Exp (2019)

סרטון זה מדגים את יצירת נגיף נשימתי סינציטיאלי (RSV) רקומביננטי המבטא חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP) באמצעות מערכת גנטיקה הפוכה מבוססת T7. טרנספקציה משותפת של פלסמידים המקודדים לחלבונים ויראליים ושל גנום מתויג ב-GFP מובילה לביטוי חלבון ומניעה את הצלת הנגיף.

פרוטוקול

1. הצלה ומעבר ראשון של נגיף רקומביננטי

הערה: בצע את כל השלבים הבאים בסביבה סטרילית, תוך שימוש במנדף ביטחון מסוג class II.

1. ביום שלפני הטרנספקציה, הכינו תרחיף של שורת התאים BSRT7/5 בריכוז של 5 x 10⁵ cells/mL במצע מלא. חלקו 2 mL של תרחיף התאים לכל באר בפלטה של 6 בארות. הכינו באר אחת עבור כל נגיף שעתידו להציל (rescue) ובאר נוספת כביקורת שלילית. דגרו את הפלטה ב-37 °C וב-5% CO₂. ודאו שהתאים הגיעו ל-80%–90% התלכדות (confluence) למחרת.
2. הפשיתו את וקטורי הגנטיקה ההפוכה של נגיף הסינציטיום הנשמי (RSV), p-RSV-GFP ו-p-RSV-M2-1-GFP, וכן את p-N, p-P, p-L ו-p-M2-1. עבור כל נגיף להצלה, ערבבו במבחנה 1 µg של p-N ו-p-P, ‏0.5 µg של p-L, ‏0.25 µg של p-M2-1 ו-1.25 µg של p-RSV (GFP או M2-1 GFP).
   הערה: ניתן להשתמש בווקטורים שונים לביטוי חלבונים ויראליים של קומפלקס הפולימראז (N, P, L ו-M2-1); עם זאת, יש לשמור על היחס בין החלבונים. בצעו את הביקורת השלילית על ידי החלפת וקטור ה-p-RSV בווקטור ריק.
3. המשיכו לביצוע הטרנספקציה (ראו טבלת חומרים).
   1. הוסיפו 250 µL של מצע עם סרום מופחת לווקטורים המעורבבים. במבחנה אחרת, דללו 10 µL של רכיב הטרנספקציה ב-250 µL של מצע עם סרום מופחת. ערבבו בעדינות את שתי המבחנות בוורטקס והמתינו 5 דקות. ערבבו את התוכן של שתי המבחנות והמתינו 20 דקות בטמפרטורת החדר.
   2. שטפו את תאי ה-BSRT7/5 ב-1 mL של מצע עם סרום מופחת וחלקו 1.5 mL של Minimal essential medium (MEM) עם 10% fetal calf serum (FCS) ללא אנטיביוטיקה לכל באר. במידת הצורך, דגרו ב-37 °C וב-5% CO₂ עד לסיום הדגירה המתוארת בשלב 1.3.1.
   3. הוסיפו 500 µL מתערובת הטרנספקציה שהוכנה בשלב 1.3.1 לבאר עם סיום זמן הדגירה של 20 דקות. הניחו את התאים באינקובטור ב-37 °C וב-5% CO₂ למשך 3 ימים. אין להחליף את מצע התרבית של התאים במהלך הטרנספקציה.
4. עקבו אחר פלואורסצנציה של חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP) (עירור ב-488 nm ופליטה ב-515–535 nm) תחת מיקרוסקופ פלואורסצנציה הפוך בהגדלה של 20x פעם ביום כדי לנטר את יעילות ההצלה, תוך שימוש במסנן GFP.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
BSRT7/5		לא זמין מסחרית	ראו סימוכין 22. Buchholz et al. 1999
מיקרוסקופ פלואורסצנציה לתצפיות	Olympus	IX73 Olympus microscope
מיקרוסקופ פלואורסצנציה לווידאו-מיקרוסקופיה	Olympus	ScanR Olympus microscope
HEp-2	ATCC	ATCC CCL-23
HEPES ≥99.5%	Sigma	H3375
L-Glutamine (200 mM)	ThermoFisher Scientific	25030024
סוכן Lipofactamine 2000	ThermoFisher Scientific	11668019	הפרוטוקול בשלב 2.3. עבר אופטימיזציה עבור סוכן זה.
MEM (10x), ללא גלוטמין	ThermoFisher Scientific	11430030
MEM, תוסף GlutaMAX	ThermoFisher Scientific	41090-028
MgSO4 ReagentPlus, ≥99.5%	Sigma	M7506
מצע Opti-MEM I עם סרום מופחת	ThermoFisher Scientific	51985-026
פלסמידים		לא זמין מסחרית	ראו סימוכין 21. Rameix-Welti et al. 2014