בדיקת טיטרציה של פלאקים לכימות של נגיף הסינציטיום הנשימתי (RSV) זיהומי

תקציר

מקור: Bouillier, C., ועמיתיהם יצירה, הגברה ותיתור של נגיפי סינציטיום נשימי (RSV) רקומביננטיים. .J. Vis. Exp (2019)

הסרטון מדגים בדיקת טיטרציה של פלאקים (plaque titration assay) המשמשת לכימות של נגיף סינציטנלי נשימתי (RSV) רקומביננטי זיהומי בשכבות מונו-שכבה של תאי אפיתל. הוא מציג את הדבקת תאי המאכסן באמצעות תרחיפי נגיף בדילולים סדרתיים, את הגבלת התפשטות הנגיף על ידי שכבת כיסוי חצי-מוצקה מבוססת תאית, ואת היווצרות פלאקים מקומיים כתוצאה מאפקטים ציטופתיים. הפרוצדורה מסתיימת בצביעה, דה-קונטמינציה וספירת פלאקים כדי לקבוע את הטיטר הנגיפי ולהעריך את זיהומיות ה-RSV.

פרוטוקול

1. בדיקת טיטר פלאקים (Plaque Titration Assay)

1. הכינו פלטות של 12 בארות עבור הטיטרציה ביום שלפני ביצוע בדיקת הטיטרציה (שש בארות יהיו נחוצות לטיטרציה של מבחנה אחת של נגיף). זרעו בבארות 1 מ"ל של תאי אפיתל אנושיים מסוג 2 (HEp-2) בריכוז של 5 × 10⁵ תאים/מ"ל במצע גידול מלא.
2. למחרת, הכין תרחיף תאית מיקרוקריסטלית סטרילי (2.4% [משקל/נפח] במים) (ראה טבלת חומרים).
   1. פזרו 2.4 גרם של אבקת תאית מיקרוקריסטלית (microcrystalline cellulose) ב-100 מ"ל מים מזוקקים, באמצעות בוחש מגנטי סטנדרטי, עד להמסה מלאה של האבקה (בדרך כלל 4–12 שעות). עקרו את התמיכה באוטוקלאב ב- 121 °C למשך 20 דקות ואחסנו אותו בטמפרטורת החדר לפני השימוש.
      הערה: בתנאים אלו, התרחיף יציב למשך שנה אחת.
   2. לאחר פתיחת התמיסה בסביבה סטרילית, יש לאחסן אותה ב- 4 °C במשך 6 חודשים. יש לערבב תמיד את התמיהה לפני השימוש (על ידי ניעור ידני או וורטקס) כדי להבטיח שהיא הומוגנית.
3. הכינו את ה-2× מצע גידול חיוני מינימלי (MEM) בסביבה סטרילית. לדלל MEM מסחרי 10× עם מים סטריליים והוסיפו L-glutamine, 1,000 יחידות/מ"ל פניצילין ו-1 מ"ג/מ"ל סטריפטומייצין. נערו את התמיסה בעוצמה ואחסנו אותה ב- 4 °C.
   הערה: בצעו את שלבים 1.4–1.10 בסביבה סטרילית באמצעות מCב בטיחות מסוג Class II.
4. הכינו שש מבחנות המכילות 900 µL של MEM ללא סרום מעגל עגרי (FCS) עבור כל נגיף שיועמד לטיטירה (מבחנות הטיטירה). הפשיר את מנות הנגיף, ערבב אותן בעזרת וורטקס בעוצמה למשך 5 שניות, והעבר 100 µL למבחנת הטיטרציה הראשונה.
5. בצעו דילול של פי עשרה (10x)×, באופן הבא. הוסף 100 μL של נגיף ל- 900 μL של מצע למבחנה הראשונה, סגור את המבחנה במכסה, וערבב את תכולתה באמצעות וורטקס למשך מספר שניות. החלף את טיפ הפפטה והוסף 100 µL של הדילול הראשון ל- 900 µL של מצע למבחנה השנייה, סגור את מכסה המבחנה ובצע ערבוב ב-vortex. חזור על הפעולה עד למבחנה השישית.
   הערה: חשוב מאוד להחליף את הטיפ עבור כל דילול.
6. כתבו את שם הנגיף ואת פי השמיגול (fold dilutions) על פלטות ה-12 בארות מסוג HEp-2. סמנו את הפלטה ואת המכסה שלה כך שניתן יהיה להתאימם, כיוון שהם עלולים להיפרד במהלך הצביעה (שלב 1.9). הסירו את המצע מהפלטות וחלקו 400 µL של דילול אחד לכל באר. דגרו את הפלטות ב- 37 °C במשך שעתיים, לצורך ספיחה של הנגיף.
   הערה: החליפו את טיפ הפפיטה בין כל תהליכי ההחדרה (inoculum), או עבדו מהריכוז הנמוך לגבוה באמצעות אותו טיפ. הדביקו מספר מוגבל של צלחות (1 עד 2) בו-זמנית כדי למנוע התייבשות של התאים.
7. הכינו את שכבת הכיסוי של תרחיף התאית המיקרו-גבישית במהלך ספיגת הנגיף (הכנה רגעית). כדי להכין 100 מ"ל של שכבת כיסוי, ערבבו 10 מ"ל של תרחיף תאית מיקרו-גבישית בריכוז 2.4%, 10 מ"ל של 2× MEM, ו-80 מ"ל של MEM עם 2% FCS.
   1. כווננו את ה-pH של ה-2× את ה-MEM לסביב 7.2 באמצעות תמיסת נתרן ביקרבונט סטרילית בריכוז 7.5%, בהתאם למחוון הצבע. יש להוסיף את תרחיף התאית המיקרו-גבישית ואת ה-MEM ולערבב בעוצמה.
8. בסיום הדגירה של שעתיים, הוסיפו 2 עד 3 מ"ל של שכבת כיסוי (overlay) לכל באער בלוחות בעלי 12 באערים, ללא הסרת האינוקולום. יש להיזהר כדי למנוע זיהום של באערים סמוכים על ידי אינוקולומים בעלי טיטר ויראלי גבוה. דגרו את הלוח ב- 37 °C ו-5% CO2₂ במשך 6 ימים. אין להזיז את הפלטה ואין להזיז את האינקובטור במהלך הדגירה.
9. יש לצבוע את התאים באמצעות תמיסת קריסטל ויולט (8% קריסטל ויולט [נפח/נפח], 2% פורמאלדהיד [נפח/נפח] ו-20% אתנול [נפח/נפח] במים).
   1. הגנו את משטח העבודה של תא הבטיחות הביולוגית באמצעות יריעה (הקריסטל ויולט צובע משטחים בעוצמה).
   2. נערו בעדינות את הפלטות כדי להסיר את שכבת הכיסוי של מיקרו-קריסטלין צלולוז. הסירו את העל-מנת (supernatants) ושטפו את התאים 2× עם 1× סלקו-בופר פוספט (PBS). טיפלו בצלחות אחת אחת כדי למנוע מהתאים להתייבש. הוסיפו 1–2 מ"ל של תמיסת הקריסטל ויולט (crystal violet) והמתינו 10–15 דקות. הסירו את התמיסה, שניתן להשתמש בה שוב לצביעת צלחות הבאות.
   3. טבול את הפלטות והמכסים במלבין טרי למשך מספר שניות, ולאחר מכן שטוף אותם היטב במי ברז. שים לב כי הפלטות והמכסים עוברים דה-קונטמינציה באמצעות המלבין.
   4. הניחו את הפלטות והמכסים על נייר סופג והניחו להם להתייבש. ייבשו את הפלטות בטמפרטורת הסביבה לאחר השטיפה במים ואחסנו אותן בטמפרטורת החדר. לתקופות אחסון ממושכות (חודשים), שמרו את הפלטות מוגנות מאור כדי לשמור על הצבע. שימו לב כי אם התאים יאבדו מצבעם, ניתן לצבוע אותם שוב ב-crystal violet.
10. חשב את כמות הנגיפים (virus titers). ספור את הפלאקים (plaques) בבארות של הפלטות היבשות, הנראים לעין בלתי מזוינת. ודא שמספר הפלאקים בדילולים השונים הוא עקבי (פי 10 בין כל דילול). בחר בבאר שבה הפלאקים קלים ביותר לספירה. העריך את מספר הפלאקים ביחס לנפח התוכן המוחדר (inoculum volume) ולדילול.
    הערה: על בסיס הדוגמה המסופקת ב- איור 1, נספרים 21 פלאקים בדילול 10^^-5 דילול. אלו תואמים לטיטר של

תוצאות

איור 1: קביעת titer של RSV באמצעות בדיקת פלאקים (plaque assay). (A) תוצאות בדיקת טיטרציה של פלאקים בלוחית בעלת 12 בארות. מוצגות שש בארות שהודבקו בדילולות סדרתיות של מאגר נגיפי אחד. הדילולות מצוינות בלוגריתם בבסיס 10. תאים שהודבקו בשלוש הדילולות הראשונות ניתקו כולם. מספר הפלאקים שנצפו בדילולות 10^-4, 10^-5 ו-10^-6 הוא עקבי. (B) איור של ספירת הפלאקים (מספרים בצהוב). הכוכב הירוק מציין שריטות בשכבת התאים).

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
תמיסת קריסטל ויולט	Sigma	HT90132
HEp-2	ATCC	ATCC CCL-23
MEM (10x), ללא גלוטמין	ThermoFisher Scientific	11430030
MEM, תוסף GlutaMAX	ThermoFisher Scientific	41090-028
תמיסת נתרן ביקרבונט 7.5%	ThermoFisher Scientific	25080094
פניצילין-סטRepartitionפטומיצין (10,000 U/mL)	ThermoFisher Scientific	15140122