הערכת קיבולת שכפול נגיפי באמצעות בדיקת טרנסקריפטאזה הפוכה מסומנת רדיואקטיבית

תקציר

ניתוח של טרנסקריפטאזה הפוכה (RT) בתעלילי תרביות תאים הקימו מCביית בטיחות ביולוגית במתקן ברמת בטיחות ביולוגית 3 (BSL-3) לשימוש בחומרים רדיואקטיביים. הניחו נייר סופג במביית והחליפו את השואב בשואב המיועד לשימוש רדיואקטיבי. הערה: יש להשליך את כל הפסולת הרדיואקטיבית כראוי בהתאם לתקנות הבטיחות. הוסיפו 1-2 מיקרו-ליטר (µl) של [α-33P] דאוקסיטימידין טריפוספט (dTTP) בריכוז 10 mCi/ml ו-4 מיקרו-ליטר של דיתיותריטול (DTT) בריכוז 1 M לכל מנה (aliquot) של 1 מ"ל של תערובת מאסטר ל-RT (ראו טבלה 1). ערבבו בזהירות כל מבחנה למיקרוצנטריפוגה בנפח 1.5 מ"ל המכילה תערובת מאסטר ל-RT, DTT ו-[α-33P] dTTP באמצעות פיפטה של 1,000 מיקרו-ליטר והעבירו לתעלה סטרילית. חלקו 25 מיקרו-ליטר של תערובת RT מסומנת לכל באר של פלטת PCR (תגבור שרשרת פולימראז) בעלת דפנות דקות עם 96 בארות. הערה: השאירו מקום לבקרת חיוביות (זיהום MJ4 מסוג פראי (WT)) ולבקרת שליליות (זיהום דמה - Mock). הוסיפו 5 מיקרו-ליטר מכל תעליל לפלטת ה-PCR המכילה את תערובת המאסטר ל-RT. אטמו את פלטת ה-PCR עם כיסוי רדיד דביק והדגירו למשך שעתיים ב-37 מעלות צלזיוס בטרמוסייקלר. מסיבות בטיחות, שטפו את קצות הפיפטה ב-Amphyl והשליכו את קצות הפיפטה לתוך מיכל קטן המכיל פסולת Amphyl, אשר תסולק מאוחר יותר כפסולת רדיואקטיבית. לאחר ההדגרה, חוררו חורים קטנים בכיסוי הרדיד באמצעות פיפטה רב-ערוצית של 200 מיקרו-ליטר. הערה: אם קצות הפיפטה נוגעים בנוזל בבאר, החליפו את קצות הפיפטה לפני המעבר לעמודה או לשורה הבאה. ערבבו את הדגימות 5 פעמים והעבירו 5 מיקרו-ליטר מכל דגימה לנייר DE-81. ייבשו באוויר במשך 10 דקות. שטפו את הבלוטים (blots) 5 פעמים עם תמיסות מלח סודיום ציטראט (SSC) בריכוז 1x, ולאחר מכן פעמיים עם אתנול 90% למשך 5 דקות לכל שטיפה. אפשרו ייבוש באוויר. הניחו כל בלוט במיכל שטיפה נפרד, כגון קופסת אחסון מסוג סנדוויץ', הוסיפו מספיק בופר שטיפה (1x SSC או אתנול (EtOH) 90%) כדי לכסות את הבלוט, ונערה במשך 5 דקות. שפכו את בופר השטיפה למיכל נפרד וחזרו על הפעולה. הערה: 3 השטיפות הראשונות נחשבות לרדיואקטיביות ויש להשליכן כראוי. את 2 השטיפות האחרונות ניתן להשליך באופן רגיל. לאחר הייבוש, עטפו בזהירות את הבלוט בנייר נצמד (Saran wrap) וחשפו למסך פוספור (phosphoscreen) בתוך קסטה אטומה היטב למשך לילה בטמפרטורת החדר. נתחו את מסכי הפוספור באמצעות פוספורימגר (phosphorimager) וכמתו את התמלילים הרדיואקטיביים. הקיפו במעגל כל אות רדיואקטיבי באמצעות תוכנת OptiQuant. הציגו גרף של ערכי יחידות אור דיגיטליות (DLU) כדי ליצור עקומות שכפול. על מנת להפיק ציוני קיבולת שכפול, ערכי ה-DLU עברו טרנספורמציה לוגריתמית (log10), ושיעורי השיפוע חושבו לפי נקודות הזמן של ימים 2, 4 ו-6. שיפולי השכפול חולקו לאחר מכן בשיפוע של MJ4 WT כדי להפיק ציוני קיבולת שכפול. חשוב לבצע נורמליזציה על בסיס ערכי MJ4 WT שהתקבלו מאותה פלטת RT כדי להפחית שונות בתוך הבדיקה. טבלה 1: מתכון לתערובת מאסטר לבדיקת טרנסקריפטאזה הפוכה מסומנת רדיואקטיבית. הערה: יש לאחסן כמנות של 1 מ"ל בטמפרטורה של 20- מעלות צלזיות. ריאגנט | נפח (מ"ל) --- | --- H2O ללא נוקלאז | 419.5 Tris-Cl, pH 7.8 (1 M) | 30 אשלגן כלוריד (1 M) | 37.5 מגנזיום כלוריד (1 M) | 2.5 Nonidet P-40 (10%) | 5 EDTA (0.5 M) | 1.02 חומצה פוליאדנילית, מלח אשלגן (2 מ"ג/מ"ל) | 1.25 פריימר Oligo-dT (25 מיקרו-גרם/מ"ל) | 3.25 נפח כולל | 500 קלייבורן, ד. ט. ואחרים. שיטת שיבוט מבוססת אנזימי הגבלה להערכת ה- במבחנה כושר השכפול של נגיפים כימריים מסוג Gag-MJ4 של HIV-1 סב-טיפ C. .J. Vis. Exp (2014)

סרטון זה מדגים את הערכת יכולת השכפול הוויראלית באמצעות בדיקת טרנסקריפטאזה הפוכה (RT) מסומנת רדיואקטיבית. תרחיפי תרבית המכילים ויריונים צאצאים מתווספים לתערובת טרנסקריפציה הפוכה המכילה נוקלאוטיד מסומן רדיואקטיבית. האות שנשמר משקף את התפוקה הוויראלית ואת יעילות השכפול. דימות פוספורי (Phosphor imaging) משמש לזיהוי והשוואה של אותים בין דגימות הבדיקה לדגימות מסוג הבר (wild-type).

פרוטוקול

1. ניתוח של רב-טרנסקריפטאז (RT) בתעלומי תרביות תאים

1. הכינו מנדף בטיחות ביולוגית במעבדה ברמת בטיחות ביולוגית 3 (BSL-3) לשימוש עם חומרים רדיואקטיביים.
   1. הניחו נייר סופג במנדף והחליפו את השואב בשואב המיועד לשימוש רדיואקטיבי. 
      הערה: יש להשליך את כל הפסולת הרדיואקטיבית כראוי בהתאם לתקנות הבטיחות.
2. הוסיפו 1-2 µl של [α-³³P] deoxythymidine triphosphate (dTTP) בריכוז 10 mCi/ml ו-4 µl של dithiothreitol (DTT) בריכוז 1 M לכל מנה (aliquot) של 1 ml של תערובת מאסטר ל-RT (ראו טבלה 1).
3. ערבבו בזהירות כל מבחנת מיקרו-צנטריפוגה בנפח 1.5 ml המכילה תערובת מאסטר ל-RT, DTT ו-[α-³³P] dTTP באמצעות פיפט של 1,000 µl והעבירו לאגן סטרילי.
4. חלקו 25 µl של תערובת RT מסומנת לכל באער של פלטת PCR (polymerase chain reaction) בעלת 96 באערים ודפנות דקות. 
   הערה: השאירו מקום עבור ביקורת חיובית (הדבקה ב-MJ4 wild-type (WT)) וביקורת שלילית (הדבקת Mock).
5. הוסיפו 5 µl מכל עלה (supernatant) לפלטת ה-PCR המכילה את תערובת המאסטר ל-RT.
6. אטמו את פלטת ה-PCR באמצעות כיסוי רדיד דביק והדגירו למשך 2 שעות ב-37 °C בטרמוסייקלר (thermocycler). מסיבות בטיחותיות, שטפו את קצות הפיפטות עם Amphyl והשליכו את הקצות לתוך מכל קטן המכיל פסולת Amphyl, אשר תועבר מאוחר יותר לפסולת רדיואקטיבית.
7. לאחר ההדגרה, צרו חורים קטנים בכיסוי הרדיד באמצעות פיפט רב-ערוצית של 200 µl. 
   הערה: אם קצות הפיפטות נוגעים בנוזל בבאער, החליפו את קצות הפיפטות לפני המעבר לעמודה או לשורה הבאה.
8. ערבבו את הדגימות 5 פעמים והעבירו 5 µl מכל דגימה לנייר DE-81. ייבשו באוויר במשך 10 דקות.
9. שטפו את הבלוטים (blots) 5 פעמים עם 1x saline-sodium citrate (SSC), ולאחר מכן פעמיים עם אתנול 90% במשך 5 דקות לכל שטיפה. הניחו לייבוש באוויר.
   1. הניחו כל בלוט במכל שטיפה נפרד, כגון קופסת אחסון סנדוויץ', הוסיפו מספיק בופר שטיפה (1x SSC או אתנול (EtOH) 90%) כדי לכסות את הבלוט, ונערה למשך 5 דקות.
   2. שפכו את בופר השטיפה למכל נפרד וחזרו על הפעולה. הערה: 3 השטיפות הראשונות נחשבות לרדיואקטיביות ויש להשליכן כראוי. את 2 השטיפות האחרונות ניתן להשליך כפסולת רגילה.
10. לאחר הייבוש, עטפו בזהירות את הבלוט בניילון נצמד (Saran wrap) וחשפו למסך פוספורי (phosphoscreen) בתוך קסטה אטומה היטב למשך לילה בטמפרטורת החדר.
11. נתחו את המסכים הפוספוריים באמצעות phosphorimager וכמתו את התעתוקים הרדיואקטיביים.
12. סמנו בעיגול כל אות רסיגנל רדיואקטיבי באמצעות תוכנת OptiQuant. הציגו גרף של ערכי Digital Light Unit (DLU) ליצירת עקומות רפליקציה.
13. על מנת ליצור ציוני קיבולת רפליקציה, ערכי ה-DLU עברו טרנספורמציית log₁₀, והשיפועים חושבו באמצעות נקודות הזמן של ימים 2, 4 ו-6. שיפועי הרפליקציה חולקו לאחר מכן בשיפוע של WT MJ4 כדי ליצור ציוני קיבולת רפליקציה. חשוב לבצע נורמליזציה על בסיס ערכי MJ4 WT שהתקבלו מאותה פלטת RT כדי להפחית שונות בתוך הבדיקה (intra-assay variability).

טבלה 1: מתכון לתערובת מאסטר לבדיקת רב-טרנסקריפטאז רדיואקטיבית.
הערה: יש לאחסן כעתקים (aliquots) של 1 ml בטמפרטורה של -20 °C.

ריאגנט	נפח (מ"ל)
H2O נטול נוקלאז2O	419.5
Tris-Cl, pH 7.8 (1 M)	30
אשלגן כלוריד (1 M)	37.5
מגנזיום כלוריד (1 M)	2.5
Nonidet P-40 (10%)	5
EDTA (0.5 M)	1.02
חומצה פולי-אדנילית, מלח אשלגן (2 מ"ג/מ"ל)	1.25
פריימר Oligo-dT (25 μg/ml)	3.25
נפח כולל	500

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
ריאגנטים לתרבית תאים
חומר ניקוי/חיטוי Amphyl	Fisher	22-030-394
מגשי רזרבואר לפיפטות רב-ערוציות, 55 ml	Fisher	13-681-501
תמיסת Magnesium chloride 1 M	Sigma-Aldrich	M1028-100ML
ריאגנטים לבדיקת כימות Reverse-Transcriptase
dTTP, [α-³³P]- 3000 Ci/mmol, 10 mCi/ml, 1 mCi	Perkin-Elmer	NEG605H001MC
Tris-Cl 1 M, pH 8.0	Life Technologies/Invitrogen	15568025	יש לכוון ל-pH 7.8 באמצעות KOH
Potassium chloride (KCl) 2 M	Life Technologies/Invitrogen	AM9640G	יש לדלל לתמיסה של 1 M
EDTA 0.5 M	Life Technologies/Invitrogen	15575-020
Nonidet P40	Roche	11333941103
מלח אשלגן של Polyadenylic acid (Poly rA)	Midland Reagent Co.	P-3001
Oligo d(T) primer	Life Technologies/Invitrogen	18418-012
Dithiothreitol (DTT)	Sigma-Aldrich	43815-1G
מסך פוספור ברזולוציה גבוהה (SR), קטן	Perkin-Elmer	7001485
פלטת 96 בארות מדגם Polycarbonate Thermowell של Corning Costar	Fisher	07-200-245	מיוצר על ידי Corning Life
סרט איטום אלומיניום לא סטרילי לפלטת 96 בארות של Corning	Fisher	07-200-684	מיוצר על ידי Corning Life
נייר חילוף אניוני DE-81	Whatman	3658-915
Trisodium citrate dihydrate	Sigma-Aldrich	S1804-1KG
Sodium Chloride	Fisher	S671-3
קסטת אוטורדיוגרפיה	Fisher	FB-CA-810
מסך פוספור לאחסון Cyclone	Packard
תרמוציקלר, PTC-200	MJ Research