הכנת דגימות לכימות נגיפי מבוסס לוסיפראז

תקציר

1. הכנת דגימות השג דגימות המכילות נגיף המבטא לוסיפראז (כאן VSV∆51-Fluc כדוגמה) לצורך מדידת תיתור (titration) והעברה לפלטות בעלות 96 בארות. לחלופין, בצע הדבקות בפלטות תרבית רקמה בעלות 96 בארות והשתמש בת上-סופרנטאטים באופן ישיר. השאר שתי עמודות ללא טיפול עבור הכללת עקומות סטנדרט. עבור ניסויים המבוצעים ישירות בפלטות בעלות 96 בארות, בצע תיתור בסוף הניסוי (40 שעות לאחר ההדבקה) או אחסן בטמפרטורה של 80- °C ובצע תיתור במועד מאוחר יותר. 2. הכנת תאים רגישים (Permissive Cells) לתיתור נגיפי 24 שעות לפני התיתור, הכן תרחיף של תאי Vero בריכוז של 2.5 x 10⁵ תאים/מ"ל בתווך Dulbecco’s modified eagle medium (DMEM) המכיל 10% סרום בקר עוברי (FBS), 30 mM של 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES), ו-1% פניצילין/סטריפטומייצין. הערה: אף על פי שפרוטוקול זה משתמש בתאי Vero, ניתן להשתמש בכל שורת תאים רגישה מתאימה להדבקה בנגיף הסטומטיס של השפפון (VSV). זריע 2.5 x 10⁴ תאים (100 מיקרו-ליטר) בפלטות לבנות בעלות תחתית שטוחה ומוצקה עם 96 בארות באמצעות מפזר מיקרו-פלטות (microplate dispenser). הכן 12 מ"ל של תרחיף תאים לכל פלטה, בתוספת 5 מ"ל להחלחלה (priming). נקה את קסטת מפזר המיקרו-פלטות על ידי שטיפת הצינורות ב-50 מ"ל מים סטריליים. מלא את קווי מפזר המיקרו-פלטות בתרחיף תאים והנח ל-5 מ"ל מתרחיף התאים לזרום החוצה. בחר תוכנית שתפיץ 100 מיקרו-ליטר לכל בארה בפלטה לבנה בעלת 96 בארות. פזר, וחזור על הפעולה במידת הצורך עבור פלטות נוספות. כמו כן, זריע מספר בארות בפלטה שקופה בעלת תחתית שטוחה עם 96 בארות, במידה ונעשה שימוש בפלטות לבנות בעלות תחתית אטמה, לצורך אימות בריאות התאים וצפיפותם. בסיום, שטוף את התאים חזרה אל המכל המקורי. נקה את הקסטה על ידי העברת 50 מ"ל אתנול 70%, ולאחריו 50 מ"ל מים סטריליים חמים דרך הצינורות. ודא שהקסטה והצינורות מנוקים כראוי בין שימושים. הדגר את התאים למשך 24 שעות בטמפרטורה של 37 °C באינקובטור לח עם 5% CO2. 3. הכנת עקומת סטנדרט נגיפית הכן עקומת סטנדרט של VSV∆51-Fluc ב-DMEM ללא סרום, כך שהריכוז הסופי של יחידות יוצרות פlaque (pfu) למ"ל לאחר ההעברה לתאי Vero יהיה כדלקמן: 10⁸ pfu/ml, 10⁷ pfu/ml, 10⁶ pfu/ml, 10⁵ pfu/ml, 10⁴ pfu/ml, 10³ pfu/ml, 10² pfu/ml, ו-10¹ pfu/ml. הכן 50 מיקרו-ליטר מכל ריכוז לכל פלטה של תאי Vero, בתוספת 10% רזרבה. הערה: יהיה צורך להעריך את התיתור של מלאי נגיף הלוסיפראז בדרך קלאסית על מנת להפיק עקומת סטנדרט שתאפשר כימות מוחלט. אחרת, ניתן להשיג כימות יחסי ללא מידע מדויק על התיתור על ידי קביעה שרירותית של התיתור הנגיפי בהתבסס על שלבי הדילול. לדוגמה, הדילול הראשון של עקומת הסטנדרט עשוי להיקבע כ-10⁸ יחידות נגיפיות, והדילול הבא של 1/10 ל-10⁷, וכן הלאה. בהקשר זה, יש להביע ערכים כשינוי של פי כמה (fold-change) בהשוואה לדגימה שנקבעה מראש, שכן כימות מוחלט לא יהיה מדויק. 4. העברת סופרנטאטים של דגימות אל תאים רגישים בדוק את תאי ה-Vero שנזרעו בפלטה בעלת התחתית השקופה עם 96 הבארות תחת מיקרוסקופ אור כדי לוודא שהשכבות החד-שכבתיות (monolayers) נמצאות ב confluence של 95% לפחות. העבר 25 מיקרו-ליטר של סופרנטאט מהדגימה אל תאי Vero שנזרעו בפלטות לבנות. אל תעביר סופרנטאטים לשתי העמודות המיועדות לעקומות הסטנדרט. הערה: ניתן לבצע זאת בו-זמנית עבור כל הבארות בפלטה אחת באמצעות מטפל נוזלים בעל 96 ערוצים. באמצעות פיפטה רב-ערוצית בעלת 8 או 12 ערוצים, הוסף 25 מיקרו-ליטר מכל דילול של עקומת הסטנדרט שהוכנה בשלב 3 לתאי ה-Vero בשתי העמודות המיועדות. סובב את הפלטות בצנטריפוגה למשך 5 דקות ב-430 x g בטמפרטורת החדר (RT). הדגר למשך 5 שעות בטמפרטורה של 37 °C באינקובטור לח עם 5% CO2. גרסיה, ו., ואח'. טיטרציה בסביבה של תפוקה גבוהה של נגיפים רקומביננטיים המבטאים לוסיפראז. J. Vis. Exp. (91), e51890, doi:10.3791/51890 (2014).

סרטון זה מדגים את הכנת דגימות תרביות תאים להערכת העומס הוויראלי באמצעות בדיקה המבוססת על לוסיפראז. הוא מפרט את תהליך הדבקת תאים אפיתליאליים בנגיף שעבר שינוי גנטי, העברת על-נוזלים וסטנדרטים ויראליים לבארות הבדיקה, וקידום החדירה הוויראלית באמצעות צנטריפוגה ואינקובציה. ביטוי הלוסיפראז משמש כחלבון רפורטר, המאפשר כימות של הריכוז הוויראלי על בסיס פלט של אות לומנסצנטי.

פרוטוקול

1. הכנת דגימות

1. השיגו דגימות המכילות נגיף המבטא לוסיפרז (כאן VSV∆51-Fluc כדוגמה) לצורך טיטרציה והעבירו אותן לפלטות בעלות 96 בארות. לחלופין, בצעו הדבקות בפלטות תרביות רקמה בעלות 96 בארות והשתמשו בעילי-הנוזל (supernatants) באופן ישיר.
2. השאירו שתי עמודות ללא טיפול לצורך הוספת עקומות סטנדרט. עבור ניסויים המבוצעים ישירות בפלטות בעלות 96 בארות, בצעו טיטרציה בסיום הניסוי (40 שעות לאחר ההדבקה) או אחסנו ב-80 °C- ובצעו טיטרציה במועד מאוחר יותר.

2. הכנת תאים רגישים (Permissive Cells) לטיטר נגיפי

1. 24 שעות לפני הטיטרציה, הכינו תרחיף של תאי Vero בריכוז של 2.5 x 10⁵ תאים/מ"ל בתווך Dulbecco’s modified eagle medium (DMEM) המכיל 10% סרום עגל עוברי (FBS), 30 mM של 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES), ו-1% פניצילין/סטRepartitionימיצין. 
   הערההערה: אף שפרוטוקול זה משתמש בתאי Vero, ניתן להשתמש בכל שורת תאים חדירה (permissive) המתאימה להדבקה בנגי הסטומטיס הוסיקולרי (VSV).
2. זרע 2.5 x 10⁴ תאים (100 μl) בלוחיות לבנות בעלות תחתית שטוחה ומוצקה עם 96 בארות באמצעות מפזר מיקרו-לוחיות (microplate dispenser).
   1. הכינו 12 מ"ל של תרחיף תאים לכל פלטה, ובנוסף 5 מ"ל לצורך הכנה (priming).
   2. נקה את קסטת המפיץ של המיקרו-פלטה על ידי שטיפת הפיתולים ב-50 מ"ל מים סטריליים.
   3. מלאו את קווי הפיזור של פזרת המיקרו-פלטות בתרחיף תאים והניחו ל-5 מ"ל מתרחיף התאים לזרום דרכם.
   4. בחר תוכנית שתבצע חלוקה של 100 μl בכל באר של פלטת 96 באערים בעלת דפנות לבנות. בצע את החלוקה, וחזור על הפעולה ככל שיידרש עבור פלטות נוספות. כמו כן, זרע מספר באערים בפלטת 96 באערים שקופה בעלת תחתית שטוחה, במידה ונעשה שימוש בפלטות בעלות דפנות לבנות ותחתית אטומה, וזאת לצורך אימות בריאות התאים וצפיפותם.
   5. בסיום הפעולה, החזירו את התאים למכל המקורי על ידי שטיפה. נקו את הקסטה על ידי העברת 50 מ"ל אתנול 70%, ולאחריהם 50 מ"ל מים סטריליים חמים דרך צינורות ההובלה.
   6. ודא שהקסטה והצינורות נקיים כראוי בין שימוש לשימוש.
3. דגרו את התאים למשך 24 שעות ב- 37 °C באינקובטור לח 5% CO2₂ אינקובטור.

3. הכנת עקומת סטנדרט ויראלית

1. הכינו עקומת סטנדרט של VSV∆51-Fluc ב-DMEM נטול סרום כך שהריכוז הסופי של יחידות יוצרות פלאקים (pfu) למל' לאחר ההעברה לתאי Vero יהיה כדלקמן: 10⁸ pfu/ml, 10⁷ pfu/ml, 10⁶ pfu/ml, 10⁵ pfu/ml, 10⁴ pfu/ml, 10³ pfu/ml, 10² pfu/ml, ו-10¹ pfu/ml. הכינו 50 μl מכל ריכוז לכל פלטה של תאי Vero, בתוספת 10% רזרבה.
   הערה: יהיה צורך להעריך את הטר (Titer) של מלאי נגיף הלוקיפראז בשיטה קלאסית כדי להפיק עקומת סטנדרט שתאפשר כימות מוחלט. אחרת, ניתן לבצע כימות יחסי ללא מידע מדויק על הטר על ידי קביעה שרירותית של הטר הנגיפי בהתבסס על שלבי הדילול. לדוגמה, ניתן לקבוע את הדילול הראשון של עקומת הסטנדרט כ-10⁸ יחידות נגיף, ואת דילול ה-1/10 הבא כ-10⁷, וכן הלאה. בהקשר זה, יש לבטא ערכים כשינוי-מכפלה (fold-change) בהשוואה לדגימה שנקבעה מראש, כיוון שכימות מוחלט לא יהיה מדויק.

4. העברה של ת上-סופרנאטנטים מהדגימות לתאי מארח רגישים

1. בדוק תאי Vero שנזרעו בלוח 96-בארים בעל תחתית שקופה תחת מיקרוסקופ אור כדי לוודא שהשכבות המונואלייריות (monolayers) הגיעו ללפחות 95% התלכדות (confluence).
2. העבר 25 μl של עליון הדגימה על תאי Vero שנזרעו בלוחות בעלי דפנות לבנות. אין להעביר עליונים לשתי העמודות המיועדות לעקומות הסטנדרט. 
   הערה: ניתן לבצע זאת בו-זמנית עבור כל הבארים בלוח בודד באמצעות מטפל נוזלים בעל 96 ערוצים.
3. באמצעות פ pipette רב-ערוצית בעלת 8 או 12 ערוצים, הוסף 25 μl מכל דילול של עקומת הסטנדרט שהוכנה בשלב 3 לתאי ה-Vero בשתי העמודות הייעודיות.
4. סבב את הלוחות בצנטריפוגה למשך 5 min במהירות 430 x g בטמפרטורת החדר (RT).
5. דגור למשך 5 hr בטמפרטורה של 37 °C באינקובטור לח עם 5% CO₂.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
מצע מדיום של דלביקו (DMEM)	Corning	SH30243.01
סרום בקר עוברי (FBS)	NorthBio Inc.	NBSF-701
מלח פוספט מרוכז (PBS)	Corning	21-040-CV
HEPES	Fisher Scientific	BP310-1	הכן תמיסה בריכוז 1 mM, pH 7.3
מיקרופלטס פוליסטירן לבנים עם תחתית שטוחה וסולידית, 96 בארות, מטופלים לתרבית רקמות (TC)	Corning	3917	ניתן להשתמש גם בפלטות של 384 בארות לתפוקה גבוהה יותר
Synergy Mx	BioTek	SMTBL	קורא מיקרופלטס עם מונוכרומטור
Liquidator96	Mettler Toledo	LIQ-96-200	מערכת פפיטציה ידנית בעלת 96 טיפים
טיפים Liquidator96 LTS סטריליים עם פילטרים	Mettler Toledo	LQR-200F	כל טיפ סטרילי עם פילטר התואם לפפיטורים הנבחרים הוא מתאים
Microflo	BioTek	111-206-21	משמש לזריעת תאים במיקרופלטה של 96 בארות
Fluoroskan Ascent FL	Thermo Scientific	5210450	פלואורומטר למיקרופלטס