הפקת תאי גזע עובריים של עכבר שהודבקו בלנטי-וירוס

תקציר

מקור: קיארלה, א. מ. וכו' ,.et al דיכוי שעתוק גנים באמצעות הפנייה מחדש של המכניקה התאית באמצעות משנים אפיגנטיים כימיים. .J. Vis. Exp (2018)

סרטון זה מדגים יצירת תאי גזע עובריים של עכבר שעברו מודיפיקציה גנטית באמצעות טרנסדוקציה לנטיBיראלית. חלקיקים לנטיBיראליים מעבירים סמן לעמידות לאנטיביוטיקה, מה שמאפשר אינטגרציה גנומית יציבה וברירה של תאים שעברו טרנסדוקציה.

פרוטוקול

1. הדבקת תאי גזע עובריים של עכבר (mESC) עם לנטי-וירוס

1. גדלו תאי mESCs מסוג chromatin in vivo assay (CiA) מותאמים לגידול ללא תאי מאכילה (feeder-free), במעברים נמוכים (פחות ממעבר 35), במצע בסיס Dulbecco's Modified Eagle medium (DMEM) עם ריכוז גבוה של גלוקוז, מועשר ב-20% fetal bovine serum (FBS) בדרגת ESC, ‏10 mM 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES), ‏1x non-essential amino acids (NEAA), ‏Pen/Strep, ‏2-mercaptoenthanol, ו-1:500 leukemia inhibitor factor (LIF), בתוך אינקובטור בטמפרטורה של 37 °C עם 5% CO₂.
   הערה: ה-LIF מופק מהעליון (supernatant) של תאי Cos המבטאים את Lif-1C-alpha (COS LIF), אשר נאספים במנות ומוקפאים ב-80 °C-.
   1. גדלו את התאים על פלטות שעברו דגירה מוקדמת במשך 1 - 3 שעות עם 0.1% ג'לטין ב-1x phosphate-buffered saline (PBS), ולאחר מכן נשטפו ב-1x PBS. האכילו את התאים מדי יום ובצעו פיצול (split) כל 2 - 3 ימים, בהתאם לצפיפותם.
      הערה: מבחינה מורפולוגית, מושבות של תאי גזע עובריים (ES) צריכות להיות קטנות, עגולות ומופרדות זו מזו.
2. בצעו מעבר (Passage) של ה-mESC לפלטה של 12 בארות (100,000 תאים לבערה) יום אחד לפני ההדבקה.
   1. ספרו את התאים באמצעות המוציטומטר. עבור תאים שגודלו בפורמט של 10 ס"מ, שאבו את המצע הישן, הוסיפו 5 mL של 1x PBS, שאבו את ה-PBS והוסיפו 1 mL של 0.25% טריפסין. דגרו את התאים בטריפסין למשך 8 דקות ב-37 °C, תוך ניעור והקשה קלה על התאים באמצע תקופת הדגירה. מטרת שלב זה היא להביא את התאים לתליה של תאים בודדים (single-cell suspension).
3. 48 שעות לאחר החלפת המצע של תאי הכליה העובריים האנושיים 293T (HEK) מפלטה של 15 ס"מ, הסירו והעבירו את העליון למבחנה קונית של 50 mL.
4. סובבו את העליון בצנטריפוגה ב-300 x g למשך 5 דקות כדי לשקיע את שיירי התאים.
5. סננו את העליון דרך ממבנה של 0.45-µm.
   הערה: הקפידו להשתמש בממברנות cellulose acetate ללא חומר פעיל שטח (SFCA), שכן חומרים אחרים עלולים להחזיק את הנגיף ולהפחית משמעותית את התנובה.
6. רכזו את הנגיף באמצעות אולטרה-צנטריפוגציה, תוך שימוש בצנטריפוגה עם רוטור SW32, וסובבו במהירות של 20,000 rpm (~72,000 x g) למשך 2.5 שעות ב-4 °C.
7. בזמן ריכוז הנגיף באולטרה-צנטריפוגציה, טפלו בתאי ה-CiA mESCs בפלטה של 12 בארות עם מצע ES טרי המכיל 5 µg/mL של polybrene.
8. עם סיום ריכוז הנגיף, שאבו בזהירות את העליון והמיסו את משקע הנגיף ב-100 µL של 1x PBS (הימנעו מיצירת בועות מיותרות).
9. הוסיפו את הנגיף ואת ה-1x PBS למבחנת מיקרו-צנטריפוגה של 1.5 mL. ערבבו במערבל וורטקס/ניעור ב-300 x g (או בהגדרה הנמוכה ביותר) כדי להמיס את הנגיף באופן מלא. סובבו את המבחנה בצנטריפוגה שולחנית קטנה למשך 5 - 10 שניות כדי להסיר בועות.
10. הוסיפו 30 µL מהנגיף לכל בארה בפלטה של 12 בארות. סובבו את הפלטה בתנועות סיבוביות ולאחר מכן סובבו אותה בצנטריפוגה ב-1,000 x g למשך 20 דקות.
    הערה: ניתן לשנות את כמות הנגיף המתווספת בהתאם לטיטר הנגיפי, אשר נמצא ביחס הפוך לגודל מבנה ההעברה (delivery construct).
    1. לחלופין, ניתן לבצע הקפאה מהירה (flash-freeze) לנגיף באמצעות חנקן נוזלי ולאחסנו ב-80 °C-. עם זאת, הקפאת הנגיף תפחית את הטיטר הנגיפי.
11. החזירו את הפלטה של 12 הבארות לאינקובטור ב-37 °C והחליפו את המצע למחרת בבוקר (~16 שעות מאוחר יותר) למצע ES טרי.
12. 48 שעות לאחר ההדבקה, בצעו סלקציה לתאים ששילבו את הפלסמיד הנגיפי על ידי הוספת האנטיביוטיקה המתאימה (למשל, 1.5 µg/mL של puromycin, ‏10 µg/mL של blasticidin וכו'). החליפו את המצע מדי יום ושטפו את התאים ב-1x PBS אם רוב התאים צפים או מתים. השאירו את מצע הסלקציה על התאים למשך 72 - 96 שעות באינקובטור ב-37 °C עם 5% CO₂.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
DMEM	Corning	10-013CV
חומצות אמינו לא חיוניות (NEAA)	Gibco	11140-050
HEPES (לתרבית רקמה)	Corning	25-060-Cl
סרום בקר עוברי (FBS)	Atlantic Biologicals	S11550	מנות בודדות שנבדקו לאיכותן
מבחנות צנטריפוגה לנגיפים	Beckman Coulter	344058
ממברנת סינון וירוסים	Corning	431220
פוליברן (Polybrene)	Santa Cruz Biotechnology	SC134220
0.25% טריפסין	Gibco	25200-056	עם EDTA
0.05% טריפסין	Gibco	25400-054	עם EDTA
פיורומיצין	InvivoGen	הדפסה אנטיגנית
אולטרהצנטריפוגה	אופטימה	XPN-80
רוטור צנטריפוגה SW-32	Beckman Coulter	14U4354
סלי דליים עבור צנטריפוגה SW-32 Ti	Beckman Coulter	130.2
LentiX 293 תאי כליה עובריים אנושיים	Clontech	632180
PBS	Corning	46-013-CM
CiA:Oct4 mESC	בנדיבותו של G. Crabtree
תאי Cos המייצרים Lif-1C-alpha	במתנה אדיבה מ-J. Wysocka