זיהוי תאים המודבקים בווירוס ואקסיניה רקומביננטי באמצעות סלקציה מטבוליטית ופלואורסצנטית

תקציר

מקור: מרזוק, נ. ב., וכולם, מתודולוגיה ליצירה יעילה של חלבוני נגיף וקסיניה (vaccinia virus) מסומנים פלואורסצנטית. .J. Vis. Exp (2014)

סרטון זה מדגים את יצירתם של נגיפי vaccinia רקומביננטיים באמצעות רקומבינציה הומולוגית מתווכת-פלסמיד בתאי אפיתל נגועים. סמנים פלואורסצנטיים ומטבוליים מאפשרים את הבחירה והזיהוי של נגיפים המבטאים חלבונים מסומנים.

פרוטוקול

הפקה של נגיף רקומביננטי

1. בהתאם ל- איור 1הדביקו שכבה חד-שכבתית (monolayer) של תאי BS-C-1 [Buffalo Subclone C-1 (שורה של תאי אפיתל לכליה של קוף שנגזרה מתאי CV-1)] עם נגיף הוואקסיניה במצע ללא סרום בריבוי זיהום (MOI) > 1.
2. שעה אחת לאחר ההדבקה, יש להציל את התאים באמצעות מצע Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) ולבצע טרנספקציה עם תערובת של פלסמיד וקטור רקומבינציה וחומר טרנספקציה ביחס של 3:1 במצע נטול סרום.
3. לאחר 24 שעות, גרדו ואספו את התאים ב-DMEM שאינו מכיל סרום בקר עוברי (FBS), ובצעו שלושה מחזורי הקפאה-הפשרה כדי לפתוח את התאים ולשחרר את חלקיקי הווירוס.
4. בצע בדיקת פלאקים (plaque assay) עם כיסוי נוזלי של DMEM עם 10% FBS ו-GPT (Guanine Phosphoribosyltransferase (מתוך *E. coli*) סוכני ברירה, חומצה מיקופנולית (25 µg/ml), וקסנתין (250 µg/mlכדלקמן:
   1. זרע בשקעית בעלת 6 בארות שכבה אחת (monolayer) של תאי BS-C-1.
   2. הדביקו שכבות תאים (monolayers) בהfluence של 100% עם מולטיפליקציות (דילולות סדרתיות) של התאים שעברו הקפאה והפשרה ומכילים חלקיקי וירוס, וזאת כדי להבטיח הפרדה נאותה בין פלאקים בודדים.
   3. כסו בשכבה נוזלית של DMEM עם 10% FBS המכיל את רכיבי הברירה GPT – חומצה מיקופנולית וקסנתין בריכוזים סופיים של 25 µg/ml ו- 250 µg/mlבהתאמה.
5. לאחר דגירה של 24 שעות, יש להסיר את השכבה הנוזלית ולהשתמש במיקרוסקופ פלואורסצנטי כדי לחפש פלאקים המראים פלואורסצנציה אדומה דיפוזית, התואמת להטמעת mCherry מווקטור ה-TDS (transient dominant selection) אל תוך הנגיף. בהתאם לגן המטרה ולתג הפלואורסצנטי שנבחר, ניתן יהיה להבחין באותו פלאק אדום גם בפלואורסצנציה ממוקמת של הגן המסומן.
6. בחר מספר פלאקים עבור כל נגיף רקומביננטי באמצעות גירוד מקומי עם קצה של פהט ו- 100 µl של DMEM המכיל 5% FBS כדי להעביר את התאים לשפופרת Eppendorf, ולאחר מכן ביצוע שלושה סבבים של הקפאה-הפשרה לתאים שנגרדו כדי לשחרר את הנגיפים הרקומביננטיים.
7. הוסיפו את ה-DMEM המכיל את הנגיף שעבר הקפאה והפשרה לשכבה חד-שכבתית (monolayer) של תאים בלוחית 12-בארים כדי להגביר את הנגיפים הרקומביננטיים עם סוכני ברירה של GPT בתווך הגידול. גרדו את ההגבירים המוצלחים 24 שעות לאחר ההדבקה.
8. בצעו בדיקת פלאקים (plaque assay) עבור פלאקים שהורבו בהצלחה ומראים פלואורסצנציה אדומה, הפעם עם כיסוי אגרוז וסלקציה של GPT, באופן הבא:
   1. זריעה של שכבה אחת (monolayer) של תאי BS-C-1 בלוחית 6 בארות.
   2. בצעו דילול סדרתי של הוירוסים הרקומביננטיים והדביקו בארות עם דילול עולה של וירוסים ב-DMEM נטול FBS.
   3. שעה לאחר ההדבקה, יש להסיר את המצע הנוזלי ולכסות כל באר בשכבת אגרוז (agarose) בריכוז 0.5% בתוך מצע חיוני מינימלי (MEM) המכיל 2.5% FBS, 292 µg/ml L-גלוטמין, 100 U/ml פניסלין, ו- 100 µg/ml סטריפטומייצין, יחד עם סוכני הבחירה של GPT.
9. 2-3 ימים לאחר ההדבקה, בחרו פלאקים המראים פלורסצנציה שהיא הן אדומה והן בצבע התגית הפלורסצנטית הנבחרת, לצורך הגברה חוזרת, הפעם ללא סלקציה של GPT.
10. בצע את בדיקת הפלאקים הבאה עם כיסוי אגרוז ללא ברירה.
11. בחר פלאקים שאיבדו את הפלואורסצנציה האדומה הדיפוזית שלהם אך שומרים על הפלואורסצנציה המקומית המתאימה לתג שנבחר.
12. המשיכו בטיהור הפלאקים ללא ברירה כדי לקבל מלאי טהור של וירוסים רקומביננטיים שאיבדו את mCherry ואת גני הברירה gpt, אך שמרים את הפלואורסצנציה הממוקמת המתאימה לתג שנבחר. ודאו שהמלאים טהורים באמצעות בדיקת פלאקים (plaque assay); לכל הפלאקים צריכה להיות פנוטיפ פלאק דומה.

תוצאות

איור 1. תרשים של ההליך הניסויי ליצירת נגיף vaccinia רקומביננטי. האירועים המתרחשים ברמות הגנטית והתאית מוצגים, יחד עם תמונות מייצגות של פלאקים (plaque images) המפרטות את השלבים העוקבים ליצירת נגיף וקסיניה פלואורסצנטי המסומן ב-A3-GFP. (A) תאים שהודבקו בנגיף הווקסיניה (vaccinia virus) עוברים טרנספקציה עם וקטור הרקומבינציה TDS. (B) באיור זה מוצגת רק התוצאה של רקומבינציה שמאלית, והדוגמה משתמשת ב-GFP כתג הפלואורסצנטי הנבחר. רקומבינציה ימנית תביא להשתלבות של פלסמיד ה-TDS כולו בתוך הגנום באופן דומה, למעט העובדה שהתג יהיה מאוחד עם הגן מטרה כולו בשלב הביניים, כלומר, שלב ג'. ביצוע בדיקת פלאקים (plaque assay) על שכבת תאים מונושכבתית עם תערובת הרקומבינציה וחשיפתה לברירה באמצעות GPT. (C) פלאקים המראים הן פלואורסצנציה אדומה והן פלואורסצנציה ירוקה, התואמות לביטוי של mCherry ו-GFP בהתאמה, נבחרים ומועשירים. עם הסרת הברירה, תתרחש אובדן של הפלואורסצנציה האדומה התואם לאובדן של ה- gpt ו- mCherry גנים (ד'), ופלאקים המראים פלואורסצנציה ירוקה בלבד נבחרים ומרובים (E).

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
חומצה מיקופנולית (Mycophenolic acid)	Sigma-Aldrich	M3536-50MG	המסה ב-0.1 N NaOH
קסנתין (Xanthine)	Sigma-Aldrich	X0626-5G	המסה ב-0.1 N NaoH
FuGENE HD transfection reagent	Promega	E2311
מיקרוסקופ פלואורסצנציה מצויד במסנני Chroma 31001, 31002	Olympus, Chroma	BX51 (Olympus); 31001, 31002 (Chroma)