טרנסדוקציה אדנו-ויראלית משולבת עם השתקה מתווכת siRNA בתאי סרטן

תקציר

מקור: Fuchs, M. ואח'. אדנופקציה: שיטה לחקר תפקידם של מלווים מולקולריים (Molecular Chaperones) במורפודינמיקה תאית באמצעות ניסויי דלל-הצלה (Depletion-Rescue). J. Vis. Exp. (2016)

סרטון זה מדגים הובלה באמצעות אדנווירוס של טרנסגן פלואורסצנטי בשילוב עם טרנספקציית siRNA–calcium phosphate בתאי סרטן של צוואר הרחם. האדנווירוס מבטא חלבון מחליף פלואורסצנטי, בעוד שה-siRNA משרה דגרדציה ממוקדת של mRNA באמצעות קישור ל-RISC. קו-טרנספקציה רצפית זו מאפשרת knockdown סימולטני של החלבון האנדוגני והצלה (rescue) תפקודית על ידי הטרנסגן, מה שמאפשר ויזואליזציה ואישור של החלפת החלבון באמצעות דימוי פלואורסצנטי.

פרוטוקול

1. טרנסדוקציה של אדנו-וירוס ודיכוי (Knockdown) של חלבון אנדוגני באמצעות טרנספקציית RNA מפריע קטן (siRNA) בתאי HeLa-RFP-H2B באמצעות משקעי סידן פוספט (CaPi)

הערה: אדנווירוס ביקורת הנושא גן שאינו קשור (כלומר, (LacZ) או ללא גן, כדי להגיע לריבוי זיהומים (MOI) מינימלי בכל האדנופקציות (10-20 יחידות יוצרות פלאק (PFU) לתא) תוך שימוש בכמות הנמוכה ביותר של אדנווירוס רקומביננטי הנושא את הגן המבוקש.

הערה: הוכח כי נוהל זה מסייע בנורמליזציה של הביטוי לכל תא באוכלוסיית תאים גדולה.

1. יום אחד לאחר זריעת התאים, ספרו את מספר התאים מצלחת זריעה נוספת. שאבו את המצע ושטפו פעם אחת עם 1 mL של 0.05% Trypsin/ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA). הוסיפו שוב 1 mL של 0.05% Trypsin/EDTA ודגרו ב-37 °C, 5% CO₂ עד שכל התאים יdetached. הפרידו את התאים היטב באמצעות פיפט של 1 mL וספרו את מספר התאים למ"ל באמצעות haemocytometer.
2. קבעו את כמות הנגיף הדרושה כדי להעביר (transduce) את התאים ב-MOI של 2 PFU של החלבון הנבדק (POI) לתא ו-18 PFU לתא של וקטור ריק (למשל, LacZ) כדי להגיע לסה"כ 20 PFU לתא. במקביל, העבירו 4 PFU מכל baculovirus המקודד לאקטין המסומן בחלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP) ול-α-tubulin המסומן בחלבון פלואורסצנטי אדום (RFP). בצעו את הטרנסדוקציה של התאים לפי פרוטוקול ה-adenofection הבא.
3. הכינו במטרא הפוך סטרילית מבחנה מפלסטיק של 1.5 mL עבור כל תנאי והוסיפו 400 μL של alpha minimum essential medium (αMEM) חמים.
4. המיסו 천천히 על קרח מנה (aliquot) של הנגיפים, ובמידת הצורך, דללו את מלאי הנגיף כדי להוסיף נפח הגדול מ-1 μL במטרה למזער שגיאות פיפטור.
5. הוסיפו את כמות הנגיף המחושבת לכל תנאי לתוך כל מבחנת פלסטיק של 1.5 mL המכילה 400 μL αMEM וערבבו בעדינות על ידי פיפטור. החזירו מיד את מלאי הנגיף ל-80 °C- כדי לשמור על פעילותו.
6. שאבו את המצע מהתאים והוסיפו בעדינות את תערובת הנגיף בטיפות. דגרו את התאים ב-37 °C, 5% CO₂ ונערה את הצלחות בזהירות תחת המטרא הסטרילית כל 15 דקות למשך שעה אחת כדי להבטיח שהתאים מכוסים היטב בנגיף. שימוש בכמות קטנה של מצע מקל על המגע של הנגיף עם התאים.
7. לאחר הדגירה, הוסיפו בעדינות 1.6 mL αMEM לכל צלחת כדי להגיע לנפח כולל של 2 mL, התחילו את סנכרון התאים על ידי הוספת 2 mM thymidine ודגרו את התאים למשך שעתיים נוספות ב-37 °C, 5% CO₂.
8. בינתיים, הכינו את תערובת הטרנספקציה של ה-siRNA לפי שיטת הטרנספקציה של CaPi (ראו איור 1). אם אין צורך ב-siRNA, החליפו את כמות ה-siRNA במים סטריליים כדי לבצע טרנספקציה ריקה.
9. חשבו 200 μL תערובת לכל תנאי, מה שיוביל ל-400 μL עבור כפולות. הדוגמה הבאה היא עבור ריכוז siRNA סופי של 50 nM ויש להתאימה עבור כל חלבון נבדק. במבחנת פלסטיק של 1.5 mL, העבירו בפיפטה 50 μL של 1 M CaCl₂ ו-11 μL של 20 μM siRNA לתוך 139 μL של H₂O סטרילי וערבבו באמצעות vortex. לאחר סבב קצר בצנטריפוגה (spin), הוסיפו בזהירות ובטיפות 200 μL של 2× HEPES-buffered saline (HBS2x) (280 mM NaCl, 50 mM 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES), 1.5 mM Na₂HPO₄, pH 7.01-7.05).
   הערה: ככל שהטיפות קטנות יותר, כך המשקעים קטנים יותר, מה שמוביל ליעילות טרנספקציה גבוהה יותר. ערבבו בעדינות שלוש פעמים על ידי הזרקת אוויר באמצעות פיפט של 200 μL.
10. דגרו את התערובת למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר (RT). הוסיפו לאט 200 μL מתערובת הטרנספקציה לכל צלחת ונערה בתנועה מצליבה. העבירו את הצלחות ל-37 °C, 5% CO₂ למשך 16 שעות.
11. למחרת, שטפו את התאים פעמיים עם 2 mL HEPES חמים (6.7 mM KCl, 150 mM NaCl, 10 mM HEPES, pH 7.3) והוסיפו 2 mL αMEM. אין להמשיך עם יותר מארבע צלחות תאים בו-זמנית, כיוון ששינויים בטמפרטורה משפיעים על אורך מחזור התא.
12. הדמינו את יעילות ההדבקה תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי הפוך בהגדלה של 20-40x (אוויר) וקבלו שלוש תמונות מייצגות לכל תנאי הן בערוץ הפלואורסצנטי והן בערוץ הטרנסמיסיה לצורך תיעוד. שבע שעות לאחר מכן, הוסיפו 2 mM thymidine ודגרו למשך 16 שעות נוספות ב-37 °C, 5% CO₂.
13. ביום למחרת, 48 שעות לאחר טרנספקציית siRNA והדבקת הנגיף, שטפו את התאים פעמיים עם 2 mL phosphate-buffered saline (PBS) חמים ושחררו למשך 7 שעות ב-2 mL αMEM ללא Phenol Red לצורך דימוי תאים חיים או עם Phenol Red לצורך מיצוי חלבונים.
14. אספו את התאים לכל תנאי 48 שעות לאחר הטרנספקציה להכנת תמציות חלבון ואנליזת Western blot כדי לקבוע את יעילות ה-knockdown ואת הביטוי של החלבון האנדוגני.
    הערה: השתמשו בנוגדנים נגד החלבון הנבדק וכן בנוגדנים מתאימים המשמשים כביקורת טעינה (loading controls). יש לקבוע את יעילות ה-knockdown על ידי טעינת כמויות פוחתות של ליזאטים של תאי ביקורת (שהועברו להם siRNA ביקורת) כדי לספק עקומת טיטרציה (כלומר, 1, ½, ¼, ⅛).

תוצאות

איור 1. תכנון של פרוטוקול אדנופקציה טיפוסי. השלבים העוקבים של ניסוי טיפוסי מוצגים עבור הפרוטוקול המשתמש במשקעי CaPi (קו תחתי אפור) או הפרוטוקול המשתמש ברכיב טרנספקציה של ליפיד קטיוני (מודגש בצהוב), הכוללים זריעה של תאים, טרנסדוקציה של אדנו- ובקולו-וירוסים, טרנספקציה של דופלקסים של siRNA, וסנכרון תאים באמצעות חסימת תימידין כפולה. ציר הזמנים בשעות עבור שני הפרוטוקולים מוצג בצד ימין של האיור.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
EDTA	Sigma	E5134
סרום עגל עוברי (FBS)	Thermo Fisher	12483-020
פיברונקטין	Sigma	F1141
צלוחיות עם תחתית זכוכית, 35 mm	MatTek Corperation	P35G-1.5-20-C Case
HeLa-RFP-H2B	מתנה נדיבה מד"ר Sabine Elowe, Québec, Canada
HEPES	Fisher Scientific	BP310-1
KCl	Fisher Scientific	BP366-500
L-Glutamine	Thermo Fisher	25030081
NaCl	Fisher Scientific	BP358-10
תווך בסיסי מינימלי (MEM) Alpha	Wisent	310-101-CL
תווך בסיסי מינימלי (MEM) Alpha ללא דזוקסיריבנוקלאוזידים/ריבנוקלאוזידים	Thermo Fisher	12000-022
תווך בסיסי מינימלי (MEM) Alpha ללא Phenol Red	Thermo Fisher	41061-029
Na₂HPO₄	Biobasic	S0404
אדנווירוס בעיצוב מותאם אישית	Welgen	Custom design
סידן כלורי	Fisher Scientific	C79-500
CellLight® Actin-GFP, BacMam 2.0	Thermo Fisher	C10582
CellLight® Tubulin-RFP, BacMam 2.0	Thermo Fisher	C10614
דו-גדילי siRNA	Dharmacon	Custom design
תימידין	Sigma	T9250
טריפסין 2.5%	Thermo Fisher	15090-046