סימון של שאריות ציסטאין נגישות לפני השטח בחלקיקים דמויי נגיף מהונדסים

תקציר

1. הדבקת נגיף וטיהור חלקיקים דמויי נגיף (VLPs) מצמחי Nicotiana benthamiana הפק תמלילי T7-RNA עם כיסוי (capped) מפלסמידי וקטור המבוססים על Potato virus X (PVX) הנושאים גנים של חלבון מעטפת (CP) מסוג פרא (wild-type, wt) וגנים עם מוטציית ציסטאין של Maize rayado fino virus (MRFV), באמצעות ערכת T7-mMessage mMachine של Ambion. עבור כל תגובת תמלול T7, הדבק שני עלים שנפרסו במלואם של N. benthamiana עם 10 מיקרוליטר (μL) מתגובות התמלול והדגס את הצמחים למשך 10 ימים בחממה, בלחות של 60% למשך 16 שעות באור (25,000-30,000 לוקס) בטמפרטורה של 25 מעלות צלזיוס ו-8 שעות בחושך בטמפרטורה של 20 מעלות צלזיוס. קצור את העלים המודבקים בנגיף של N. benthamiana 10 ימים לאחר ההדבקה (dpi), שקול את רקמת הצמח (50 גרם) והנח על קרח. הומוגניז את חומר הצמח בבלנדר בנוכחות 100 מיליליטר (mL) של תמיסת בופר Na-Citrate 0.5 M מקוררת, pH 5.5 (השתמש ב-2 מיליליטר בופר לגרם של רקמת צמח). סנן את ההומוגנאט דרך 3 שכבות של בד גזה והבהר באמצעות סבוב (צנטריפוגציה) ב-27,000 × g למשך 30 דקות. העבר את הנוזל העליון (סופרנאטנט) למשורה מקוררת, מדוד את הנפח ולאחר מכן העבר לכלי זכוכית סטרילי ומקורר. השלך את המשקע (פלט). עבד את הנוזל העליון על ידי הוספת 10% פוליאתילן גליקול 8,000 (PEG 8,000), ערבב למשך 15 דקות ב-4 מעלות צלזיוס, והדגס למשך 45 דקות נוספות ב-4 מעלות צלזיוס כדי להשקיע את מטריצת ה-VLPs-PEG. סבב את הדגימה ב-27,000 × g למשך 20 דקות ב-4 מעלות צלזיוס והסר את הנוזל העליון. עבד את המשקע על ידי הוספת 8 מיליליטר של בופר Na-Citrate 0.05 M, pH 5.5, המכיל 2% Triton X-100. סובב היטב את מבחנות הצנטריפוגה כדי לשחרר את המשקע. העבר את המשקע והבופר לכלי זכוכית סטרילי ומקורר. שטוף את המבחנות מיד עם 2 מיליליטר מאותו בופר והוסף לכלי הזכוכית. ערבב את התמיה ב-4 מעלות צלזיוס עד שהמשקעים נמסים (בדרך כלל שעה אחת). הבהר באמצעות סבוב למשך 5 דקות ב-27,000 × g, השלך את המשקע, ועבד את הנוזל העליון בסבוב ב-140,000 × g למשך שעתיים ב-4 מעלות צלזיוס. השב את המשקע לתמיסה ב-1 מיליליטר בופר Na-Citrate 0.05 M, pH 5.5 והנח את התמיסה מעל מדרג סוכרוז של 10-40% שהוכן בבופר Na-Citrate 0.05 M, pH 5.5. סבב את המדרג למשך 3 שעות ב-140,000 × g ב-4 מעלות צלזיוס. האר אור מעל חלקו העליון של מבחנת הצנטריפוגה ואסוף את הפס העליון המפזר אור במרחק של 4 ס"מ מקצה המבחנה, דלל עם בופר Na-Citrate 0.05 M, pH 5.5, וסבב למשך 3 שעות ב-140,000 × g ב-4 מעלות צלזיוס. השב את המשקע לתמיסה ב-0.5 מיליליטר מים סטריליים ואחסן ב-4 מעלות צלזיוס למשך עד שישה חודשים. כמת את ריכוז ה-VLPs על ידי ביצוע בדיקת חלבון בשיטת בראדפורד (Bradford). התנובה של VLPs היא בין 1 ל-3 מיקרוגרם לגרם של רקמת צמח. 2. תגובות סימון של VLPs ב-fluorescein-5-maleimide הכן תמיסה של 1 mM fluorescein-5-maleimide (משקל מולקולרי 427.37 גרם/מול) בבופר סודיום פוספט 50 mM, pH 7.0; 1 mM חומצה אתילנדיאמין טטרה חומצת (EDTA). ערבב באמצעות וורטקס ואמת המסה מלאה. הגן על המבחנה מאור באמצעות נייר אלומיניום. הוסף fluorescein-5-maleimide ל-VLPs שהופקו בשלב 1 וערבב. השתמש בעודף מולרי של פי 25 של fluorescein-5-maleimide ביחס לכמות המולרית של סולפהידרילים. בדרך כלל, שימוש ב-30 מיקרוליטר של VLPs בריכוז של 1 מיקרוגרם למיקרוליטר ו-60 מיקרוליטר של תמיסת fluorescein-5-maleimide מניב תוצאות מקובלות. הדגס את התגובה למשך שעתיים בטמפרטורת החדר או למשך הלילה ב-4 מעלות צלזיוס. סיום את התגובה על ידי הוספת dithiothreitol (DTT) לריכוז סופי של 50 mM. הסר fluorescein שלא הגיב באמצעות עמודת סבוב להסרת מלחים (desalting spin column) של Thermo Scientific Inc., Rockford IL, וסבוב למשך 2 דקות ב-1,500 × g בטמפרטורת החדר. לניתוח באמצעות אלקטרופורזה של ג'ל פוליאקרילאמיד עם סודיום דודציל סולפט (SDS-PAGE), הוסף 10 מיקרוליטר של בופר דגימות Laemmli עבור SDS-PAGE בריכוז 2x ל-10 מיקרוליטר מכל תגובה. אחסן את החלבון המסומן תחת הגנה מאור ב-4 מעלות צלזיוס למשך עד חודש אחד, או באליקוויטות לשימוש חד-פעמי ב-20- מעלות צלזיוס למשך עד 3 חודשים. Natilla, A., ו-Hammond, R. W. ניתוח של נגישות הממס של שארי ציסטאין על חלקיקים דמויי נגיף (VLPs) של Maize rayado fino virus שהופקו מצמחי Nicotiana benthamiana וקישור צולב של פפטידים ל-VLPs. J. Vis. Exp. (2013)

סרטון זה מדגים סימון פלואורסצנטי ספציפי לאתר של חלקיקי דמויי נגיף (VLPs) מוטנטיים שהופקו ב-Nicotiana benthamiana באמצעות צבע המגיב לקבוצות תיול, ולאחריו טיהור ואלקטרופורזה של ג'ל כדי לאשר את המודיפיקציה של פני השטח.

פרוטוקול

1. הדבקה בנגיף וטיהור VLPs מצמחי Nicotiana benthamiana

1. הפיקו תמלילי T7-RNA בעלי מכסה (capped) מפלסמיד וקטור המבוסס על Potato virus X (PVX) הנושאים גנים של חלבון מעטפת (CP) מסוג פרא (wild-type, wt) ומוטציית ציסטאין של Maize rayado fino virus (MRFV), באמצעות ערכת T7-mMessage mMachine של Ambion.
2. עבור כל תגובת תמליל T7, הקרינו שני עלים רחבים לחלוטין של N. benthamiana עם 10 μL מהתגובה, והדגרימו את הצמחים במשך 10 ימים בחממה, בלחות של 60% למשך 16 שעות עם תאורה (25,000-30,000 lux) בטמפרטורה של 25 °C ו-8 שעות בחשכה בטמפרטורה של 20 °C.
3. קצרו עלים של N. benthamiana שנדבקו בנגיף 10 ימים לאחר ההקראה (dpi), שקלו את רקמת הצמח (50 גרם) והניחו על קרח.
4. הומוגניזו את חומר הצמח בבלנדר בנוכחות 100 mL של תמיסה מקוררת של בופר Na-Citrate בריכוז 0.5 M ו-pH 5.5 (השתמשו ב-2 mL בופר לגרם של רקמת צמח).
5. סננו את ההומוגנאט דרך 3 שכבות של בד גזה והבהירו באמצעות צנטריפוגציה ב-27,000 × g למשך 30 דקות. העבירו את העילוי למשחוק מקורר, מדדו את הנפח, ולאחר מכן העבירו לכלי זכוכית סטרילי מקורר. השליכו את המשקע.
6. עבדו את העילוי על ידי הוספה של 10% פוליאתילן גליקול 8,000 (PEG 8,000), ערבבו במשך 15 דקות ב-4 °C, והדגרימו למשך 45 דקות נוספות ב-4 °C כדי להשקיע את מטריצת ה-VLPs-PEG (חלקיקים דמויי נגיף).
7. צנטריגו את הדגימה ב-27,000 × g למשך 20 דקות ב-4 °C והסִירו את העילוי.
8. עבדו את המשקע על ידי הוספת 8 mL של בופר Na-Citrate בריכוז 0.05 M ו-pH 5.5, המכיל 2% Triton X-100. סובבו היטב את מבחנות הצנטריפוגה כדי לשחרר את המשקע. העבירו את המשקע והבופר לכלי זכוכית סטרילי מקורר. שטפו מיד את המבחנות ב-2 mL מאותו בופר והוסיפו לכלי הזכוכית. ערבבו את התושה ב-4 °C עד שהמשקעים יתמוססו (בדרך כלל שעה אחת).
9. הבהירו באמצעות צנטריפוגציה למשך 5 דקות ב-27,000 × g, השליכו את המשקע, ועבדו את העילוי על ידי צנטריפוגיה ב-140,000 × g למשך שעתיים ב-4 °C.
10. השביו את המשקע ב-1 mL בופר Na-Citrate בריכוז 0.05 M ו-pH 5.5 והניחו את התושה מעל מדרג סוכרוז של 10-40% שהוכן בבופר Na-Citrate בריכוז 0.05 M ו-pH 5.5.
11. צנטריגו את המדרג למשך 3 שעות ב-140,000 × g ב-4 °C.
12. האირო אור מעל חלקו העליון של מבחנת הצנטריפוגה ואספו את הפס העליון המפזר אור במרחק של 4 cm מהחלק העליון של המבחנה, דללו עם בופר Na-Citrate בריכוז 0.05 M ו-pH 5.5, וצנטריגו למשך 3 שעות ב-140,000 × g ב-4 °C.
13. השביו את המשקע ב-0.5 mL של מים סטריליים ואחסנו ב-4 °C למשך עד שישה חודשים.
14. כמתו את ריכוז ה-VLPs על ידי ביצוע בדיקת חלבוני בראדפורד (Bradford). תנובת ה-VLPs היא בין 1 ל-3 μg/g של רקמת צמח.

2. תגובות סימון של VLPs באמצעות fluorescein-5-maleimide

1. הכינו תמיסה ריכוזה 1 mM של fluorescein-5-maleimide (427.37 g/mole) בבופר sodium phosphate ריכוז 50 mM, pH 7.0; 1 mM ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA). ערבבו באמצעות וורטקס (vortex) וודאו שהחומר התמוסס לחלוטין. הגנו על המבחנה מפני אור באמצעות נייר אלומינום.
2. הוסיפו fluorescein-5-maleimide ל-VLPs שהופקו בשלב 1 וערבבו. השתמשו בעודף מולרי של פי 25 של fluorescein-5-maleimide ביחס לכמות המולרית של קבוצות הסולפהידריל. בדרך כלל, שימוש ב-30 μL של VLPs בריכוז של 1 μg/μL ו-60 μL של תמיסת fluorescein-5-maleimide יניב תוצאות מקובלות.
3. דגרו את התגובה במשך 2 שעות בטמפרטורת החדר או למשך לילה ב-4 °C.
4. סיימו את התגובה על ידי הוספת dithiothreitol (DTT) עד לריכוז סופי של 50 mM.
5. הסירו fluorescein שלא הגיב באמצעות עמודת ספין להסרת מלחים (desalting spin column; Thermo Scientific Inc., Rockford IL) וצנטריפוגציה למשך 2 דקות ב-1,500 × g בטמפרטורת החדר.
6. לניתוח Sodium Dodecyl Sulfate Polyacrylamide Gel Electrophoresis (SDS-PAGE), הוסיפו 10 μL של 2 × SDS-PAGE Laemmli sample buffer ל-10 μL מכל תגובה. אחסנו את החלבון המסומן כשהוא מוגן מאור ב-4 °C למשך עד חודש, או באליקוואוטים לשימוש חד-פעמי ב-20 °C- למשך עד 3 חודשים.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
מבחנות דופן דקה, שקופות במיוחד	Beckman	344059
ערכה של mMESSAGE mMACHINE T7	Life Technologies	AM1344M
פלואורסצאין-5-מלאימיד	Thermo Scientific Life Technologies	46130 F150	46130 אינו תקין, החליפו ב-F150
בופר Laemmli	Bio-Rad	1610737
בופר הרצה של Tris-Glycine SDS (סודיום דודציל סולפט)	Invitrogen	LC2675
בופר העברה של Tris Glycine	Invitrogen	LC3675
סנדוויץ' של נייר מסנן מממברנת ניטרוצלולוז	Invitrogen	LC2001
EZ-Link Maleimide-Polyethylene glycol (PEG) 2-Biotin, בפורמט ללא שקילה (No-Weigh Format)	Thermo Scientific	21901