הדבקה אינטראנזאלית בנגיף ההרפס של העכבר בעכברים להערכת תגובות חיסוניות של המארח

תקציר

כל ההליכים הכוללים מודלים של בעלי חיים נסקרו על ידי הוועדה המוסדית המקומית לטיפול בבעלי חיים ועל ידי ועדת הבקרה הווטרינרית של JoVE. 1. הפרשת ציטוקינים באמצעות ELISA בעכברים נגועים ב-γHV68 הרדימו אחים ואחיות של עכברי C57BL/6 (B6) תואמי מין, בני 6-8 שבועות (8-12 עכברים לקבוצה), באמצעות הזרקה תוך-פריטונית של 1.5 מ"ג קטמין/0.12 מ"ג של קסילזין, וחצנו תוך-אפית עם 40 PFU (יחידה יוצרת פlaque) של γHV68 ב-40 µl. בנקודות זמן שונות לאחר ההדבקה, הרגו את העכברים באמצעות שאיפת CO2 ולאחריה פריקה צווארית. פתחו את בית החזה באמצעות חתך צדי שמאלי לאורך העצם הסטרנום וחתכו את הצלעות במספריים חדים. אספו את רקמות הריאה. אספו מחצית מרקמת הריאה (האונו השמאלית) לתוך מבחנות סטריליות עם מכסה הברגה בנפח 1.5 מ"ל המכילות 500 µl של חרוזי זירקוניה/סיליקה בערך 1.0 מ"מ. הוסיפו למבחנה 1 מ"ל של DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium) קר ללא סרום, והומוגניזרו את רקמת הריאה באמצעות טחינה בחרוזים (bead-beating) למשך 30 שניות. קררו את המבחנות על קרח למשך 2 דקות וחזרו על תהליך זה פעם אחת. סובבו את המבחנות בצנטריפוגה (15,000 x g למשך 10 דקות) בטמפרטורה של 4 °C, אספו את העלייה (supernatant) ומדדו את ייצור הציטוקינים כפי שמתואר להלן. מדדו ציטוקינים באמצעות ערכות ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) לציטוקינים הזמינות מסחרית, בהתאם להוראות היצרן. ג'אנג, ג', ואחרים. פ. ניתוח של סיגנלינג חיסוני מולד בחמיקה נגיפית מייצור ציטוקינים. J. Vis. Exp. (2014)

סרטון זה מדגים הזרקה תוך-אפית של הרפס-וירוס עכברי בעכברים כדי להשרות תגובה חיסונית ספציפית לריאות. רקמת הריאה מעובדת לאחר מכן כדי להפיק על-נוזלים המכילים ציטוקינים לצורך הערכה של תגובות המערכת החיסונית של המארח בשלבים הבאים.

פרוטוקול

כל ההליכים הכוללים מודלים של בעלי חיים נסקרו על ידי ועדת הרווחה לבעלי חיים המוסדית המקומית ועל ידי מועצת הביקורת הווטרינרית של JoVE.

1. הפרשת ציטוקינים באמצעות ELISA בעכברים שהודבקו ב-γHV68

1. הרדמו עכברי C57BL/6 (B6) בני 6-8 שבועות, תואמי מין מאותה השבחה (8-12 עכברים לקבוצה), על ידי הזרקה תוך-פריטוניאלית של 1.5 mg ketamine/0.12 mg xylazine, וחסנו אותם באופן תוך-אפי (intranasally) עם 40 PFU(Plaque-forming unit) של γHV68 ב-40 µl. בנקודות זמן שונות לאחר ההדבקה, בצעו איוותן לעכברים באמצעות שאיפת CO₂ ולאחריה פריקה צווארית.
2. פתחו את בית החזה בחיתוך צדי שמאלי לאורך העצם הסטרנום וחתכו את הצלעות בעזרת מספריים חדים. אספו את רקמות הריאה.
3. אספו חצי מרקמת הריאה (האונה השמאלית) לתוך מבחנות סטריליות בנפח 1.5 ml עם מכסה הברגה, המכילות 500 µl של חרוזי זירקוניה/סיליקה בקוטר 1.0 mm. הוסיפו למבחנה 1 ml של DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium) קר וללא סרום, והומוגניזו את רקמת הריאה באמצעות bead-beating למשך 30 sec. קררו את המבחנות על קרח למשך 2 min וחזרו על תהליך זה פעם אחת.
4. סובבו את המבחנות בצנטריפוגה (15,000 x g למשך 10 min) בטמפרטורה של 4 °C, אספו את העילאי (supernatant) ומדדו את ייצור הציטוקינים כפי שמתואר להלן.
5. מדדו את הציטוקינים באמצעות ערכות ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) לציטוקינים הזמינות מסחרית, בהתאם להוראות היצרן.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
ערכה ל-ELISA של CCL5 בעכברים	R&D Systems	DY478
חרוזי Zirconia/Silica בגודל 1.0 mm	BioSpec Products	11079110z