מאמר שיטה

ייצור של חלקיקים דמויי-וירוס ב-E. coli מהונדסת

47 צפיות

⸱

30 בספטמבר 2026

במאמר זה

תקציר

ביטוי של Qβ נגב את שטח העבודה בתמיסת אקונומיקה/אתנול ביחס של 1:1. הכן שני תרביות התנעה של 3 מ"ל בסביבה אספטית על ידי הוספת מושבות בודדות של E. coli BL21(DE3) לתוך 3 מ"ל של מצע Super Optimal Broth (SOB) בסביבה אספטית. גדל במנער במהירות של 250 סל"ד בחדר בטמפרטורה של 37 °C ובלחות יחסית (rH) של 0% למשך הלילה. החדר את תרבית ההתנעה במצע SOB: הוצא את שתי תרביות ההתנעה של 3 המ"ל מהמנער, ובסביבה אספטית, שפוך כל תרבית התנעה לאחד משני בקבוקי ארלנמייר עם מחיצות (baffled) בנפח של 2 ליטר, המכילים כל אחד ליטר אחד של מצע SOB טרי. הצב את המצע המוחדר במנער במהירות של 250 סל"ד בחדר בטמפרטורה של 37 °C ובלחות יחסית של 0%. גדל את החיידקים במנער במהירות של 250 סל"ד בחדר בטמפרטורה של 37 °C ובלחות יחסית של 0% עד שערך ה-OD600 יגיע ל-0.9–1.0. הוסף 1 מ"ל של 1 M isopropyl β-D-1 thiogalactopyranoside (IPTG) באמצעות פיפטת P1000 כדי להשרות את ביטוי החלבון. השאר את המצע במנער במהירות של 250 סל"ד בחדר בטמפרטורה של 37 °C ובלחות יחסית של 0% למשך הלילה. הוצא את המצע מהמנער למחרת בבוקר וסבב אותו בצנטריפוגה באמצעות בקבוקים של 1000 מ"ל ב-20,621 × g למשך שעה אחת ב-4 °C כדי לאסוף את התאים. שפוך את הנוזל העליון (supernatant) ואסוף את משקע התאים. שפוך את הנוזל העליון לבקבוק עם כ-5 מ"ל של אקונומיקה כדי להרוג את החיידקים. זהו פסולת. השתמש בשפכטל כדי לגרד את משקע התאים מתחתית בקבוק הצנטריפוגה והעבר את המשקע לשפופרת צנטריפוגה של 50 מ"ל. צ'ן, Z., וכו'הכנת חלקיקים דמויי נגיף (VLPs) פלואורסצנטיים פגילציהיים המודעים על ידי צימוד באמצעות כימיה של דיברומומאליימיד-דיסולפיד. .J. Vis. Exp (2018)

סרטון זה מדגים את השיטה לביטוי מבוקר של חלבון המעטפת של הבקטריופאג Qβ בחיידקי E. coli מהונדסים. החלבונים המתקבלים מרכיבים עצמית לחלקיקים דמויי וירוס, הנאספים לצורך ביקונוגציה ביולוגית בהמשך התהליך.

פרוטוקול

ביטוי של Qβ

  1. נגב את אזור משטח העבודה עם תמיסת bleach/ethanol ביחס של 1:1.
  2. הכן שני תרביות התנעה של 3 mL בסביבה אספטית על ידי הוספת מושבות בודדות של E. coli BL21(DE3) לתוך 3 mL של מצע Super Optimal Broth (SOB) בסביבה אספטית.
  3. גדל במנער במהירות של 250 rpm בחדר בטמפרטורה של 37 °C ובלחות יחסית (rH) של 0% למשך הלילה.
  4. החדל את תרבית ההתנעה למצע SOB:
    1. הוצא את שתי תרביות ההתנעה בנפח 3 mL מהמנער, ובסביבה אספטית, שפוך כל תרבית התנעה לתוך אחד משני בקבוקי ארלנמאייר בעלי מחיצות (baffled) בנפח 2 L, המכילים כל אחד 1 L של מצע SOB טרי.
    2. הנח את המצע המוחדל במנער במהירות של 250 rpm בחדר בטמפרטורה של 37 °C ו-0% rH.
  5. גדל את החיידקים במנער במהירות של 250 rpm בחדר בטמפרטורה של 37 °C ו-0% rH עד שערך ה-OD600 מגיע ל-0.9–1.0.
  6. הוסף 1 mL של 1 M isopropyl β-D-1 thiogalactopyranoside (IPTG) באמצעות פפיט P1000 כדי להשרות ביטוי חלבון.
  7. השאר את המצע במנער במהירות של 250 rpm בחדר בטמפרטורה של 37 °C ו-0% rH למשך הלילה.
  8. הוצא את המצע מהמנער למחרת בבוקר וסבב אותו בצנטריפוגה באמצעות בקבוקים של 1000 mL במהירות של 20,621 × g למשך 1 h בטמפרטורה של 4 °C כדי לקצור את התאים.
  9. השלך את הנוזל העליון (supernatant) ואסוף את משקע התאים.
    1. שפוך את הנוזל העליון לתוך בקבוק עם כ-5 mL של bleach כדי להרוג את החיידקים. זהו פסולת.
    2. השתמש בשפכטל (spatula) כדי לגרד את משקע התאים מהתחתית של בקבוק הצנטריפוגה והעבר את המשקע לתוך מבחנה לצנטריפוגה בנפח 50 mL.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
LB Broth (Miller)EMD Millipore1.10285.0500 
טריפטון, אבקהResearch Products InternationalT60060-1000.0 
תמצית שמרים, אבקהResearch Products InternationalY20020-1000.0 
מגנזיום סולפט אנहाइडריP212121CI-06808-1KG 
נתרן כלוריד (גבישי/מאושר ACS)Fisher ScientificS271-10 
אשלגן כלורידFisher ScientificBP366-500 
מערכת לטיהור מים Elga PURELAB Flex 3Fisher Scientific4474524 
אשלגן פוספט מונובסיFisher ScientificBP362-1 
אשלגן פוספט דיבסי אנहाइडריFisher ScientificP288-500 
Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG)Sigma AldrichI6758-1G 
בקבוקי צנטריפוגה Nalgene עם פקקים, קופולימר פוליפרופילןThermo Scientific3141-0250 
מנער אורביטלי VWR Os-500VWR Scientifc Products14005-830 
פיפטמן P1000GilsonF123602 
מבחנה קונית לצנטריפוגה Falcon בנפח 50 mLFisher Scientific14-432-22 

תגיות

בקטריופאג Q Betaביטוי חלבון מעטפתמקדם T7אופרטור Lacהרכבה עצמית של חלבוןאינדוקציית IPTGטיהור משק תאיםצנטריפוגה