פונקציונליזציה פלואורסצנטית של חלקיקים דמויי נגיף באמצעות בנייה מחדש של גשרי דיסולפיד

תקציר

מקור: צ'ן, ז', וחב' יצירת חלקיקים דמויי נגיף (Virus-like Particles) פלואורסצנטיים שעברו פגילציה (PEGylation) באמצעות צימוד המונחה על ידי כימיית דיברומומאליימיד-דיסולפיד. .J. Vis. Exp (2018)

סרטון זה מדגים פונקציונליזציה פלואורסצנטית של חלקיקים דמויי נגיף על ידי חיבור מחדש של גשרי דיסולפיד מרופחים באמצעות מקשר פוליאתילן גליקול (PEG), ליצירת קונג'וגטים יציבים וניתנים למעקב המתאימים לדימוי תאי ומסירה ממוקדת ביישומים ביו-רפואיים.

פרוטוקול

1. הצמדה של תרכובות דיברומומאליימיד (DB) לבקטריופאג Qβ

1. הפחתת גשרי דיסולפיד ב-Qββ.
   1. המס 0.0020 גרם של tris(2-carboxyethyl)phosphine (TCEP) ב-1 מ"ל של מים אולטרה-טהורים להכנת תמיסת מלאי בריכוז 100x.
      הערה: יש להכין TCEP טרי לפני החזרת החמצון.
   2. הוסף 200 µL של Qβ (5 mg/mL) לתוך מבחנת מיקרו-צנטריפוגה.
   3. לאחר מכן יש להוסיף 20 µL של תמיסת מלאי TCEP בריכוז 100x.
   4. דגרו בטמפרטורת החדר למשך שעה אחת.
2. בצע בנייה מחדש של הגשר הדיסולפידי המופחת באמצעות דיברומומאליימיד פוליאתילן גליקול (DB-PEG).
   1. המס 0.0017 גרם של דיברומומאליימיד-פוליאתילן גליקול (DB-PEG) ב- 100 µL של DMF.
   2. הוסף 680 µL של תמיסת נתרן פוספט 10 mM (pH 5).
   3. הוסף Qβ שעבר רדוקציהβ אל תוך תמיסת ה-DB-PEG ועקבו אחר תהליך הערבוב תחת מנורת UV (על-סגול) של 365 ננומטר. ניתן להבחין מיד עם הערבוב בפלואורסצנציה צהובה בהירה באמצעות מנורת UV ידנית של 365 ננומטר.
   4. יש להמשיך בתגובה למשך הלילה בטמפרטורת החדר (RT) על גבי רוטסרי (rotisserie).
3. טהרו את תערובת התגובה באמצעות מסנן צנטריפוגלי (סף חיתוך למשקל מולקולרי (MWCO) = 10 kDa) שלוש פעמים באמצעות 1x PBS (סליין במאפר פוספט) ב-3,283 x g למשך 20 דקות ב- 4 °C.
4. יש לנטר את הצמידה באמצעות SDS-PAGE (אלקטרופורזה של ג'ל פוליאקרילאמיד עם סודיום דודציל סולפט) בתנאים לא מחזרים ואלקטרופורזה של ג'ל אגרוז נטיבי.
   הערה: VLPs (חלקיקים דמויי נגיף) נעים כחלקיקים שלמים בג'ל אגרוז נתיבי (native), והם מופרדים על סמך המטען, הגודל והצורה שלהם.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
2 3-דיברומומאליימיד 97%	Sigma Aldrich	553603-5G
פוליאתילן גליקול	Alfa Aesar	41561-22
נתרן פוספט	Fisher Scientific	AC424375000
אקרילאמיד/ביס-אקרילאמיד	P212121	RP-A11310-500.0
סודיום דודציל סולפט	Sigma Aldrich	L3771-100G
אמוניום פרסולפט	Fisher Scientific	BP179-100
יחידות סינון צנטריפוגיות Amicon Ultra-4	Millipore Sigma	UFC801024
מבחנה קונית לצנטריפוגה Falcon בנפח 15 מ"ל	Fisher Scientific	14-959-53A
מבחורת מיקרוצנטריפוגה: 1.5 מ"ל	Fisher Scientific	05-408-129
מנער אורביטלי VWR Os-500	מוצרי VWR Scientific	14005-830
Pipetman P1000	Gilson	F123602
Pipetman P200	Gilson	F123601
פיפטמן P100	Gilson	F123615
Pipetman P20	Gilson	F123600
Pipetman P10	Gilson	F144802
Intel Weighing PM-100 מאזנ מעבדה קלאסי בעל דיוק גבוה	טכנולוגיית שקילה חכמה	IWT_PM100