הכנה בטוחה של דגימות נגיפיות למיקרוסקופיה אלקטרונית חודרת (TEM)

תקציר

מקור: Blancett, C. D., ואח'שימוש בקפסולות לצביעה שלילית של דגימות נגיפיות בתוך הכלה ביולוגית. J. Vis. Exp. (2017).

סרטון זה מדגים הכנה בטוחה של דגימות נגיף עבור מיקרוסקופיה אלקטרונית חודרת (TEM). חלקיקי הנגיף מקובעים באמצעות glutaraldehyde, נצבעים בחומר בעל צפיפות אלקטרונית גבוהה, ועוברים קיבוע באדי osmium tetroxide כדי לייצב את המבנים ולהבטיח אינאקטיבציה מלאה, ובכך להבטיח טיפול בטוח בדגימות נגיף תוך שיפור הניגודיות לצורך הדמיית TEM באיכות גבוהה.

פרוטוקול

1. שיטת הקפסולה לצביעה שלילית תחת בידוד ביולוגי באמצעות גלוטראלדהיד מימי והשבתה באמצעות אדי אוסמיום טטראוקסיד 1%

1. בתוך קבינת בטיחות ביולוגית (BSC) של הכלה ביולוגית, שאבו 40 µL של תרחיף נגיף לתוך הקפסולה המחוברת לפיפט.
   הערה: הפיפט נשאר מחובר לקפסולה עד לסיום התהליך.
2. הניחו את הפיפט על צדו למשך 10 min כאשר הרשתות מונחות באופן אופקי. זאת כדי לעודד פיזור אחיד של חלקיקי הנגיף על הרשתות המצופות.
3. בצעו נטרול של הנגיף בתוך הקפסולה בתוך ה-BSC של ההכלה הביולוגית.
   1. הרימו את הפיפט ולחצו על הבוכנה כדי להעביר את תמיסת הנגיף למכל פסולת.
   2. שאבו 40 µL של מקבע glutaraldehyde בריכוז 2% לתוך הקפסולות. אזהרה: Glutaraldehyde הוא כימיקל מסוכן הדורש הגנה מתאימה. ניתן להשתמש ב-Glutaraldehyde לפרקי זמן קצרים ב-BSC רגיל, אך עבודה ממושכת עם הריאגנט פתוח מחייבת עבודה ב-BSC עם ניקוז או במכסה מסיח כימיים.
   3. הניחו את הפיפט על צדו למשך 20 min. זאת כדי להבטיח קיבוע תקין של הדגימות.
   4. רוקנו את המקבע ושאבו 40 µL של מים DI (דה-יוניים) לתוך הקפסולות כדי לשטוף את המקבע. חזרו על שלב שטיפה זה עבור סך של 3 מחזורי שטיפה.
4. שאבו 40 µL של uranyl acetate (UA) בריכוז 1% או של potassium phosphotungstic acid (PTA) בריכוז 1% לתוך הקפסולות והמתינו 30 s.
   הערה: זמן הצביעה עשוי להשתנות בין 10 s ל-1 min בהתאם לדגימת הנגיף.
   אזהרה:: UA הוא פולט אלפא ורעל מצטבר. טפלו בו עם הגנה מתאימה.
5. הסירו את הקפסולה מהפיפט וייבשו את הרשתות באמצעות ניגוב, על ידי נגיעה של פיסת נייר סינון בקצה הרשתות בעודן בתוך הקפסולה.
6. נוהל נטרול באמצעות אדי Osmium Tetroxide.
   1. הניחו את הקפסולה, כשהמכסה פתוח, לתוך מבחנת צנטריפוגה של 50 mL המכילה נייר סינון ספוג בתמיסת osmium tetroxide בריכוז 1%. אזהרה: Osmium tetroxide רעיל ביותר עם לחץ אדים נמוך. יש להשתמש בו ב-BSC עם ניקוז או במכסה מסיח כימיים. טפלו בו עם הגנה מתאימה. הצמידו מידע אזהרה באזור העבודה.
   2. אטמו את מבחנת הצנטריפוגה של 50-mL למשך 1 h כדי לאפשר חדירה מלאה של אדי ה-osmium tetroxide. לאחר מכן, בצעו דה-קונטמינציה והעבירו את המבחנה אל מחוץ לאזור ההכלה הביולוגית למתקן ה-EM (מיקרוסקופ אלקטרוני) ברמת BSL-2.
7. הוציאו את רשתות ה-EM מהקפסולה.
   1. במתקן ה-EM ברמת BSL-2, הוציאו את הקפסולה ממבחנת הצנטריפוגה והניחו אותה על פיפט.
   2. שאבו 40 µL של מים DI לתוך הקפסולה ורוקנו את המים למכל פסולת שלוש פעמים.
   3. הסירו את הקפסולה מהפיפט וייבשו את הרשתות באמצעות ניגוב, על ידי נגיעה של נייר סינון בקצה הרשתות.
   4. לאחר ייבוש באוויר, אחסנו את הרשתות לצורך דימוי TEM (מיקרוסקופיה אלקטרונית חודרת) בהמשך.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
סריגי TEM מצופים ב-Formvar/carbon	SPI	3420C-MB	200 mesh Cu Pk/100
קפסולות mPrep/g	EMS	85010-01	קופסה
מחברים mPrep/f	EMS	85010-11	standard 16/Pk
גלוטרדהיד	EMS	16320	תמיסה 50%, בדרגת EM
אוסמיום טטראוקסיד	EMS	19190	תמיסה מימית 4%
אורניל אצטט	EMS	22400	אבקה
חומצה פוספו-טונגסטית של אשלגן	EMS	19500	אבקה
נייר סינון	Whatman	1450-090	גודל 50
מיקרוסקופ אלקטרונים חודר	JEOL	JEM-1011	TEM