שחזור וטיהור במעבדה (In Vitro) של חלקיקים דמויי נוקלאוקפסיד נגיפיים

תקציר

מקור: Gao, Y., et al. יצירה והרכבה של נוקלאוקפסيدات ספציפיות לנגיף של נגיף הסינציטיומ של דרכי הנשימה. J. Vis. Exp. (2021)

הסרטון מדגים הרכבה in vitro של נוקלאוקפסيدات ספציפיות לנגיף מקומפלקס מטהר של נוקלאופרוטאין-פוספופרוטאין נטול RNA, את טיהורן באמצעות כרומטוגרפיית החרגתו גודל, ואימות של RNA ויראלי באורכו המלא בתוך החלקיקים המורכבים.

פרוטוקול

1. שיבוט מולקולרי

הערה: שיטת שיבוט ללא ליגאז (LIC) שימשה ליצירת פלסמיד של קונסטרוקט בי-סיסטרוני לביטוי משותף של נגיף הסינציטיום הנשמי (RSV). LIC היא שיטה שפותחה בתחילת שנות ה-90, המשתמשת בפעילות Exo 3’-5’ של T4 DNA polymerase כדי ליצור קצוות בולטים עם קומפלמנטריות בין הווקטור לבין מקטע ה-DNA המוחדר. הקונסטרוקטים נוצרו באמצעות DNA של ווקטור 2BT-10, הכולל תג 10x His בקצה ה-N-terminal של מסגרת הקריאה הפתוחה (ORF) (איור 1).

1. בצע ליניאריזציה של וקטורי LIC באמצעות עיכול SSPI.
   1. ערבב 10 μL של באפר SSPI 10X, ‏4 μL של אנזים SSPI בריכוז של 5 U/μL, נפח שווה ערך ל-5 μg של DNA של וקטור miniprep, ו-ddH₂O סטרילי עד לנפח של 100 μL.
   2. דגירה של תערובת העיכול למשך 3 שעות ב-37 °C.
   3. הרץ את תוצר העיכול על ג'ל אגרוז 1.0% לצורך מיצוי DNA של הווקטור.
   4. השתמש בערכה למיצוי ג'ל כדי לבצע מיצוי וטיהור. המס את הנפח הסופי של ה-DNA של הווקטור ב-30 μL של ddH₂O ושמור אותו ב-20 °C-.

2. הכן את מקטעי ה-DNA עבור N1-391 ו-P1-126 באמצעות הפרימר N1-391 Forward, הפרימר N1-391 Reverse, הפרימר P1-126 Forward והפרימר P1-126 Reverse (טבלה 1).

   הערה: קיימת חפיפה מספקת עם הווקטור הליניארי כדי להבטיח טמפרטורת התכה שבין 55 °C ל-60 °C. עבור הפרימר ה-Reverse, קיימת חפיפה מספקת עם הגדיל המשלים ההפוך (reverse complementary strand) של הווקטור הליניארי מאותה סיבה.

   טבלה 1. רצפי פרימרים.

   פרימרים	רצף
   N1-391 Forward	5’-TACTTCCAATCCAATGCAATGGCCCTGAGCAAAGTGAAG-3’
   N1-391 Reverse	5’-TTATCCACTTCCAATGTTATTACAGTTCCACGTCGTTGTCCTTGG-3'
   P1-126 Forward	5’-TACTTCCAATCCAATGCAATGGAAAAGTTCGCCCCCGAG-3'
   P1-126 Reverse	5’-TTATCCACTTCCAATGTTATTACTGGTCGTTGATTTCCTCGTAGC-3’

   1. בצע הגברה באמצעות תגובת שרשרת פולימראז (PCR) של מקטע ה-DNA בתנאים המפורטים בטבלה 2 ובטבלה 3.
   2. מצת את מקטע ה-DNA שהוגבר. הרץ את תוצרי ה-PCR מהשלב הקודם על ג'ל אגרוז 1.0%, ולאחר מכן המצת וטהר את הפסים באמצעות מיצוי ג'ל. המס את הנפח הסופי של ה-DNA הממוצת ב-15 μL של ddH₂O.

   טבלה 2. ריאגנטים להגברת PCR של מקטע DNA.

   הגברת PCR של מקטע DNA
   15 μL	באפר תגובה ל-Pfu polymerase בריכוז 10x
   3 μL	פרימר Forward (בריכוז 100 μM)
   3 μL	פרימר Reverse (בריכוז 100 μM)
   15 μL	תערובת Deoxynucleotide Triphosphate (dNTP) בריכוז 2.5 mM
   6 μL	DNA של פלסמיד המכיל את הגן של N או P (בנפח 100ng/ μL)
   7 μL	Dimethyl Sulfoxide (DMSO)
   3 μL	Pfu polymerase בריכוז 2.5U/μL
   השלמה לנפח של 150 μL	ddH2O סטרילי

   טבלה 3. תוכנית מחזורי תרמי להגברת PCR של מקטע DNA.

   הגברת PCR של מקטע DNA
   שלב	זמן	טמפרטורה	מחזורים
   דנטורציה	4 דקות	95 ºC	1
   דנטורציה	45 שניות	95 ºC	30
   היברידיזציה (Annealing)	30 שניות	62 ºC
   הארכה (Extension)*	90 שניות	72 ºC
   הארכה	10 דקות	72 ºC	1
   שמירה (Hold)	∞	4 ºC	1
   ניתן להריץ את תערובת ה-150 μL בשלוש תגובות PCR נפרדות (3 x 50μL).
   *עבור Pfu DNA polymerase, המהירות המומלצת לשלב ההארכה היא 1 kb/min. במקרה זה, אורכם של הגן N1-391 או הגן P1-126 קצר מ-1.5 Kb. לכן, השתמשו ב-90 שניות עבור שלב ההארכה.

3. טיפול ב-T4 DNA polymerase של ה-DNA של הווקטור והמקטע (טבלה 4).

   טבלה 4. טיפול ב-T4 DNA polymerase.

   טיפול ב-T4 DNA polymerase
   באפר 10 x	2 μL
   DNA של וקטור/מקטע (0.1 pmol וקטור או 0.2 pmol מקטע)	5 μL
   dNTP* בריכוז 25 mM	2 μL
   DTT בריכוז 100 mM	1 μL
   T4 DNA polymerase (באישור LIC)	0.4 μL (1.25 U)
   ddH2O סטרילי	9.6 μL
   *השתמשו ב-dGTP עבור הווקטור, וב-dCTP עבור ה-DNA של המקטע.

   הערה: יש לבצע את הטיפול בנפרד עבור ה-DNA של הווקטור ועבור ה-DNA של המקטע.

   1. דגירה של התערובת למשך 40 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, בצעו אינאקטיבציה תרמית של הפולימראז ב-75 °C למשך 20 דקות. שמרו את תערובת התגובה ב-20 °C-.
4. ביצוע היברידיזציה (Annealing) לווקטור ה-LIC ולווקטור המקטע.
   1. הכינו ביקורת שלילית עם 2 μL של DNA של וקטור LIC ו-2 μL של ddH₂O סטרילי.
   2. ערבבו 2 μL של DNA של מקטע ו-2 μL של DNA של וקטור LIC מתגובות T4 DNA polymerase הקודמות בתוך מבחנה של 0.2 mL.
   3. בצעו את תגובת ההיברידיזציה בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות.
   4. עצרו את התגובה באמצעות 1.3 μL של Ethylenediaminetetraacetic Acid (EDTA) בריכוז של 25 mM.
   5. טרנספורמציה של התגובה לתוך 100 μL של תאים קומפטנטים של Escherichia coli Top10 והפזרו אותם על צלחת סלקציה עם אמפיסילין.
5. זיהוי הקונסטרוקטים החיוביים.
   1. הכינו תמיסת פלסמיד miniprep. ניתן לעשות זאת על ידי בחירת מושבות והספקה למדיית Luria Broth (LB). בדרך כלל, 3 מושבות מספיקות.
   2. דגירה של התערובת למשך לילה ב-37 °C.
   3. צנטריפוגציה של התערובת ב-4,560 x g למשך 10 דקות והסרת הנוזל העליון (supernatant).
   4. הססה מחדש של המשקעים ב-250 μL של באפר P1 והכנת plasmid minipreps באמצעות ערכת spin miniprep.
   5. ביצוע ניתוח עיכול של תוצר ה-miniprep באמצעות AseI או אנזימי הגבלה אחרים.
   6. העמסת דגימות על ג'ל אגרוז 0.8% והרצת הפלסמיד המעוכל. ניתוח הג'ל תחת מנורת UV.
   7. השתמשו בשירות ריצוף כדי לאמת את הרצף של התוצר החיובי.

6. השגת מקטע ה-DNA לביטוי משותף (coexpression).

   1. בצעו PCR כדי להשיג את N1-391 ו-P1-126 תוך שימוש ב-2BT-10 N1-391 ו-2BT-10 P1-126 שבנו קודם לכן כתבניות.
   2. בצעו את ה-PCR הראשון להשגת N1-391 מקונסטרוקט 2BT-10 N1-391 באמצעות תנאי ה-PCR בטבלה 2 ובטבלה 3 עם הפרימר N1-391 Forward והפרימר Reverse 5 ́-GTGAAGATCCTGGCTGATGCAATGCGGCGGCGCGCCGCGATCGCGGATCC-3 ́.
   3. בצעו את ה-PCR השני להשגת P1-126 מקונסטרוקט 2BT-10 P1-126 באמצעות הפרימר Forward: 5’-CCGCCGCATTGCATCAGCCAGGATCTTCACTGCAGGACTCGAGTTCTAGA-3 ́והפרימר P1-126 Reverse (השתמשו בתנאי ה-PCR בטבלה 2 ובטבלה 3).
   4. לבסוף, בצעו overlap PCR על תוצרי התערובת של שתי תגובות ה-PCR הקודמות כדי למזג את N1-391 ו-P1-126. השתמשו בפרימר N1-391 Forward ובפרימר P1-126 Reverse. השתמשו בתנאי ה-PCR בטבלה 5 ובטבלה 6.

   טבלה 5. ריאגנטים ל-Overlap PCR.

   Overlap PCR
   15 μL	באפר תגובה ל-Pfu polymerase בריכוז 10 X
   3 μL	פרימר Forward (100 μM)
   3 μL	פרימר Reverse (100 μM)
   15 μL	תערובת dNTP (2.5 mM)
   3 μL	DNA מסבב PCR ראשון המכיל את הגן N1-391 (100 ng/μL )
   3 μL	DNA מסבב PCR ראשון המכיל את הגן P1-126 (100 ng/μL )
   7 μL	DMSO
   3 μL	Pfu polymerase (2.5 U/μL)
   השלמה לנפח של 150 μL	ddH2O סטרילי

   טבלה 6. תוכנית מחזורי תרמי ל-Overlap PCR.

   Overlap PCR
   שלב	זמן	טמפרטורה	מחזורים
   דנטורציה	4 דקות	95 °C	1
   דנטורציה	45 שניות	95 °C	30
   היברידיזציה (Annealing)	30 שניות	62 °C
   הארכה (Extension)*	2 דקות	72 °C
   הארכה	10 דקות	72 °C	1
   שמירה (Hold)	∞	4 °C	1
   ניתן להריץ את תערובת ה-150 μL בשלוש תגובות PCR נפרדות (3 x 50 μL).
   *עבור Pfu DNA polymerase, המהירות המומלצת לשלב ההארכה היא 1 kb/min. במקרה זה, האורך הכולל של הגנים N1-391 ו-P1-126 קצר מ-2.0 Kb. לכן, השתמשו ב-2 דקות עבור שלב ההארכה.

7. חיבור הווקטור ומקטע ה-DNA.
   1. טפלו בתוצר ה-overlap PCR באמצעות T4 DNA polymerase בהתאם לפרוטוקול בשלב 1.3.
   2. בצעו היברידיזציה (Annealing) לווקטור ה-LIC ולתוצר ה-PCR בהתאם לפרוטוקול בשלב 1.4.
   3. זהו את הקונסטרוקטים החיוביים בהתאם לפרוטוקול בשלב 1.5.

2. ביטוי וניקוי חלבונים

הערה: השתמש ב-E. coli עבור הקונסטרקט הבי-סיסטרוני של ביטוי משותף של N ו-P. דגור את התאים ב-37 °C, אך בצע את הביטוי בטמפרטורה מופחתת (16 °C) למשך הלילה. טהר את קומפלקסי החלבונים באמצעות שילוב של עמודת קובלט, חילוף יונים וכרומטוגרפיית גודל-הדרה (איור 2).

1. השתמש ב- *E. coli* זן BL21(DE3) לייצור חלבונים. גדלו 4 ליטר של תרביות תאים ב- 37 °C במצע LB (Luria Broth) עד ל-OD₆₀₀ מגיע ל-0.6.
2. הורד את הטמפרטורה ל- 16 °Cשעה לאחר מכן, גרו את הביטוי באמצעות 0.5 mM Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) למשך לילה.
3. סבב את התאים בצנטריפוגה ב-4,104 x g למשך 25 דקות ולאחר מכן השלף את הנוזל העליון (supernatant).
4. השביו מחדש את משקעי התאים ב-200 מ"ל של בופר ליזיס A (50 mM נתרן פוספט, pH 7.4, 500 mM NaCl, 5 mM אימידזול, 10% גליצרין ו-0.2% NP40). השתמשו ב-50 מ"ל של בופר ליזיס כדי להשביה מחדש משקעי תאים מ-1 ליטר של תרבית תאים.

5. בצעו ליזיס לתאים באמצעות סוניקציה למשך 15 דקות, במחזורים של 3 שניות פעולה ו-3 שניות הפסקה. לאחר מכן, צנטריפוגו את התאים ב-37,888 x g למשך 40 דקות.

   הערה: ניתן להשהות את הפרוטוקול על ידי הקפאת התאים לפני הסוניקציה ב-80 °C מקפיא.

6. העבירו את העל-נתיב (supernatant) לעמודת כבידה של קובלט (קוטר x אורך: 2.5 ס"מ x 10 ס"מ) המכילה כ-10 מ"ל של חרוזים שעברו שיווי משקל מוקדם עם 5–10 נפחי עמודה (CV) של בופר ליזיס.
7. שטפו את העמודה ב-5 CV של באפר B (‏50 mM Tris-HCl pH 7.4,‏ 1 M NaCl,‏ 10% גליצרין ו-5 mM אימידזול) וב-5 CV של באפר C (‏50 mM Tris-HCl pH 7.4,‏ 500 mM NaCl,‏ 10% גליצרין ו-5 mM אימידזול).
8. אלטואו את החלבון מהחרוזיים באמצעות 2 CV של באפר D (50 mM Tris-HCl pH 7.4, 500 mM NaCl, ו-250 mM imidazole).
9. דללו את החלבון שנאלוט פי 5 באמצעות באפר QA (‏50 mM Tris-HCl pH 8.0, 5% Glycerol) עבור עמודת ה-Q.
10. שטפו את עמודת ה-Q בנפח 5 מ"ל באמצעות באפר QA כדי להשכין שיווי משקל בעמודה, ולאחר מכן טענו את הדגימה המדוללת לעמודת ה-Q באמצעות משאבה פריסטלטית (למשל, Rabbit).
11. טען את עמודת ה-Q למכשיר ה-HPLC יחד עם באפר QA ובאפר QB (Tris-HCl בריכוז 50 mM, pH 7.4, NaCl בריכוז 1.5 M, גליצרול 5%). הגדר את קצב הזרימה ל-1 מ"ל לדקה.
12. הפעילו את תוכנית "pump wash" כדי לשטוף את המכשיר עם באפר QB ולאחריו באפר QA (1-2 נפחי עמודה (CVs) לכל אחד). הגדירו את קצב זרימת המערכת ל-3 מ"ל/דקה.
13. כווננו את UV1 ל-280 ננומטר ואת UV2 ל-260 ננומטר. השתמשו בלוחית 96 בארות עמוקות (deep-well plate) לאיסוף הפראקציות.
14. בצעו אלוציה של החלבונים באמצעות מדרג של סוכן אלוציה (QB Buffer) בצעדים, תוך העברת 3-4 נפחי עמודה (CV) מכל ריכוז, כאשר עולים ב-5% בכל פעם החל מ-0% QB. קומפלקס חלבוני ה-N0P יצא בריכוז של 15% QB Buffer.
15. לאחר שכל החלבון נשטף החוצה (eluted), יש לשטוף את העמודה ב-100% QB Buffer (נפח של 2 CV).
16. בודד את החלבון באמצעות עמודת סינון ג'ל Superdex 200 Increase 10/300 GL (קוטר x אורך: 1.0 ס"מ x 30 ס"מ) והשג את שיווי המשקל עם באפר E (20 mM 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid או HEPES ב-pH 7.4 ו-200 mM NaCl).
17. נתחו את הפראקציות המכילות חלבון באמצעות אלקטרופורזה של ג'ל פוליאקרילאמיד עם סודיום דודציל סולפט (SDS-PAGE).

3. הרכבה in vitro של ה-NC הספציפי לנגיף

הערה: ההרכבה in vitro של ה-NC הספציפי ל-RSV (N:RNA) בוצעה על ידי דגירה של קומפלקס N0P שהוכן עם אוליגו-RNA. לאחר מכן, נעשה שימוש בכרומטוגרפיה של הפרדה לפי גודל (SEC) כדי להפריד את קומפלקס ההרכבה מה-N0P ומעודפי RNA (איור 2).

1. ערבב והדגר את קומפלקס ה-N0P המזוקק עם אוליגו-RNA ביחס מולקולרי של 1:1.5 בטמפרטורת החדר למשך שעה אחת; בדרך כלל 1 mL של חלבון N0P בריכוז של 1 mg/mL מספיק לשלב הבא. הכן דגימת ביקורת המכילה רק את אותה כמות של חלבון N0P.
2. בצע שיווי משקל מקדים לעמודת סינון הג'ל Superdex 200 Increase 10/300 GL עם בופר E (20 mM HEPES, pH 7.4, 200 mM NaCl).
3. סבב את הדגימה בצנטריפוגה ב-21,130 x g למשך 15 דקות, הסר כל משקע והעמס את supernatant לעמודת ה-SEC.
4. השווה בין תמונות כרומטוגרפיית ה-SEC של דגימת הרכבת ה-N:RNA לבין דגימת הביקורת של N0P, ושלב את יחס ה-A260/A280 כדי לזהות אילו שיאים מייצגים את ה-N-RNA המורכב, את ה-N0P ואת ה-RNA החופשי.
5. אסוף את פרקציוני השיא, הרץ ג'ל SDS-PAGE, או הכן רשתות.
6. עבור קומפלקס N-RNA המורכב, אסוף את כל פרקציוני שיא ה-N-RNA, בצע מיצוי RNA והרץ ג'ל Urea-PAGE כדי לוודא שוב את אורכו של ה-RNA הספציפי, שהוא זהה לזה שערבב והודגר בשלב הראשון.

תוצאות

איור 1. איור של מבני הפלסמידים. א. המבנה של RSV N1-391; ב. המבנה של RSV P1-126; ג. המבנה הבי-ציסטרוני לביטוי משותף של N1-391 ו-P1-126. הגן הראשון RSV N1-391, הגן השני RSV P1-126, הגן העמיד לאנטיביוטיקה (AmpR) והפרומוטורים מודגשים בתיבות צהובות, ציאן, ורוד וכתומות, בהתאמה. לסיכום, המקטעים הגנטיים של RSV N1-391 ו-RSV P1-126 נבנו בנפרד והורכבו.

איור 2. תרשים זרימה של טיהור קומפלקס החלבונים N1-391P1-126. התרשים מפרט את ההחדרה והגידול בקנה מידה רחב של תרבית תאי E. coli ואת קציר התאים באמצעות סנטריפוגה. לאחר ליזיס של התאים, דגימות החלבון מטוהרות באמצעות כרומטוגרפיית זיקה (כלומר, עמודת Co2+), כרומטוגרפיית חילוף יונים (כלומר, עמודת Q), וכרומטוגרפיית ג'ל פילטרציה להפרדה לפי גודל (SEC). דגימות החלבון מנותחות בהמשך באמצעות ג'ל SDS-PAGE.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
Agarose	SIgma	A9539-500G	הכנת קונסטרוקט בשיטת LIC
Ampicillin sodium	GOLD BIOTECHNOLOGY	5118.111317A	אנטיביוטיקה לתרבית תאים
AseI	NEB	R0526S	הכנת קונסטרוקט בשיטת LIC
Cobalt (High Density) Agarose Beads	Gold Bio	H-310-500	לניקוי חלבוני His-tag
Corning LSE Digital Dry Bath Heater	CORNING	6885-DB	חימום הדגימה
dCTP	Invitrogen	10217016	הכנת קונסטרוקט בשיטת LIC
dGTP	Invitrogen	10218014	הכנת קונסטרוקט בשיטת LIC
Glycerol	Sigma	G5516-4L	הכנת תמיסה
HEPES	Sigma	H3375-100G	הכנת תמיסה
HiTrap Q HP	Sigma	GE29-0513-25	ניקוי חלבון
Imidazole	Sigma	I5513-100G	הכנת תמיסה
IPTG (Isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside)	GOLD BIOTECHNOLOGY	1116.071717A	השראת ביטוי חלבון
Microcentrifuge Tubes	VWR	47730-598	עבור PCR
Misonix Sonicator XL2020 Ultrasonic Liquid Processor	SpectraLab	MSX-XL-2020	סוניקטור לליזיס של תאים
New Brunswick Innova 44/44R	eppendorf	M1282-0000	שייקר לתרבית תאים
Nonidet P 40 Substitute	Sigma	74385-1L	הכנת תמיסה
OneTaq DNA Polymerase	NEB	M0480L	PCR
QIAquick Gel Extraction Kit	QIAGEN	28706	ניקוי DNA
SSPI-HF	NEB	R3132S	הכנת קונסטרוקט בשיטת LIC
Superose 6 Increase 10/300 GL	Sigma	GE29-0915-96	ניקוי חלבון
T4 DNA polymerase	Sigma	70099-3	הכנת קונסטרוקט בשיטת LIC
Thermo Scientific Sorvall RC 6 Plus Centrifuge	Fisher Scientific	36-101-0816	צנטריפוגה, מהירות מקסימלית 20,000 rpm
Trizma hydrochloride	Sigma	T3253-250G	הכנת תמיסה