זיהוי תוצרי ביניים של רפליקציית dsRNA של נגיף הזיקה באמצעות אימונוסייטוכימיה

תקציר

מקור: Contreras, D., ואחריםמערכת תרביות תאים מזוהמות בנגיף זיקה והשפעה מניעתית של אינטרפרונים במבחנה. J. Vis. Exp. (2016)

הסרטון מדגים את הגילוי של תוצרי ביניים של dsRNA של נגיף זיקה בתאי אפיתל נגועים באמצעות אימונוציטוכימיה. תאים נגועים מקובעים ולאחר מכן נחסמים באמצעות תמיסת חסימה. מוסיפים נוגדנים ראשוניים ושניוניים. הגרעינים נצבעים בצבע פלואורסצנטי. ה-dsRNA הנגיפי המסומן נצפה לאחר מכן תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי.

פרוטוקול

1. בדיקת שכפול הגנום של נגיף זיקה

1. זריעה של תאי Vero נאיביים בריכוז של 1 x 10⁵ תאים לבאר בנפחים של 2 ml באמצעות פלטה של 12 בארות. למחרת, הכנת אינוקולומים ויראליים (ריבוי זיהום (MOI) של 0.01 ו-0.1; 400 µl/באר) בתר בנמוך ובגבוה באמצעות מצע ללא סרום, בשלוש חזרות. עבור זיהום דמה (mock infection), השתמש במצע ללא סרום (400 µl/באר) בלבד.
2. דגירה של הפלטה המזהומות ב-37 °C עם 5% CO₂ למשך 4-6 שעות. פיזור האינוקולום על ידי הטיה עדינה של הפלטה לצדדים בכל שעה.
3. בסיום הדגירה, החלפת האינוקולום במצע מועשר בסרום (2 ml לבאר).
4. בנקודות הזמן של 48 ו-96 שעות, איסוף הדגימות לצורך אימונוציטוכימיה (ICC).
5. ביצוע ICC באמצעות התאים המקובעים במתנול.
   1. שטיפת התאים המקובעים שלוש פעמים עם 1x phosphate-buffered Saline (PBS) וחסימה באמצעות באפר חסימה ל-ICC (3% סרום עיזים, 3% Bovine serum albumin (BSA), 0.1% Triton-x 100 ב-PBS).
   2. שימוש בנוגדן מונוקלונלי לעכבר anti-dsRNA J2 (במנורית של 1 µg/ml) בדילול של 1:100 בבארפר חסימה ודגירה למשך לילה ב-4 °C.
   3. שטיפת התאים ב-1x PBS והוספת נוגדן שני goat anti-mouse IgG-594 (במנורית של 1 µg/ml) בדילול של 1:1,000 בבארפר החסימה ודגירה למשך שעה אחת בטמפרטורת החדר.
   4. שטיפת התאים ב-1x PBS וצביעת הגרעינים באמצעות צבע Hoechst ותצפית על התאים באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי בהגדלה של 100X (איור 1).

תוצאות

איור 1: בדיקות להערכת שכפול נגיף זיקה (ZIKV). (A) הגרף מראה את התוכן הגנומי של נגיף זיקה כפי שנמדד באמצעות תגובת שרשרת פולימראז כמותית עם שעתוק הפוך (RT-qPCR). הפריימרים עבור כל הגנוטיפים (ZIKV GEN) והפריימרים עבור זן PRVABC59 (ZIKV UNI) הראו רגישות וסגוליות שוות. כצפוי, פריימרים של נגיף דלקפת כבד C (HCV) לא הגבירו כל תוצר. (B) הגרף מציג את קינטיקת הצמיחה של נגיף זיקה בנקודות הזמן המצוינות בתאים הנגועים בטיטר נמוך ובגבוה, בהשוואה לבקרת דמי (mock) לא נגועה. מוצגים ערכי ממוצע וסטיות תקן. (C) בדיקת אימונוציטוכימיה לבדיקת שכפול נגיפי. תאים נגועים בנגיף זיקה נצבעו באופן ספציפי עם נוגדנים ל-dsRNA. ב-48 hpi, תאים נגועים מופיעים במספר מצטברים (clusters) בודדים, בעוד שב-96 hpi, מרבית התאים נגועים. צבע Hoechst שימש להדמיות של הגרעינים (סרגל קנה מידה = 50 µm). BF: תמונת שדה בהיר (Bright field).

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
מצע דאלבקו המשופר (DMEM)	Sigma Life Science	D5796
HEPES	Life Technologies	15630080
Glutamax	Life Technologies	35050061
נוגדן מונוקלונאלי לעכבר נגד dsRNA מסוג J2	אנגלית & Scientific Consulting Kft.	10010200
נוגדן Goat anti-rabbit IgG Alexa Fluor 594	Life Technologies	A11020
שורת תאי Vero	ATCC	CCL-81
זן נגיף זיקה PRVABC59	המרכזים לבקרת ומניעת מחלות (CDC)
מיקרוסקופ פלואורסצנציה Nikon Eclipse Ti עם Nikon Intenselight C-HGFI	Nikon	בקר את Nikon לצורך בקשה