ריכוז וטיהור של חלקיקי נגיף

תקציר

מקור: Fricano-Kugler, C. J., ואחרים. תכנון, אריזה והחדרה של רטרו-וירוסים ולנטי-וירוסים בטיטר גבוה המעבירים CRISPR באמצעות הזרקה סטריאוטקסית. J. Vis. Exp. (2016).

סרטון זה מדגים את התהליך שלב אחר שלב לריכוז וטיהור של חלקיקי לנטי-וירוס מתליה מעורבת המכילה שרידי תאי מאחס. הפרוצדורה משתמשת בצנטריפוגה, סינון והשקעה של PEG-מלח כדי לבודד את החלקיקים הוויראליים תוך הסרת זיהומים מסיסים. המוצר הסופי מומס מחדש בבופר ונשמר בטמפרטורות נמוכות במיוחד כדי לשמור על הזיהומיות הוויראלית ועל השלמות המבנית.

פרוטוקול

1. ריכוז וטיהור של הנגיף

1. הכינו תמיסת polyethylene glycol 6000 בריכוז 5x על ידי הוספת 40% polyethylene glycol 6000 ו-1.5 M NaCl ל-ddH₂O. בצעו אוטוקלאב לתמיסה במחזור נוזלים למשך 45 min ב-121 °C. ערבבו את התמיסה באיטיות בזמן הקירור.
   הערה: התמיסה תהיה עכורה בתחילה ואז תהפוך לצלולה ככל שתתקרר.
2. צנטריגו את המבחנה הקונית בנפח 50 ml המכילה את שתי דגימות העל-נוזל (supernatant) הוויראלי ב-2,000 x g למשך 10 min כדי לשקיע חומרים בלתי ממיסים. טהרו את המצע הוויראלי על ידי סינון דרך מסנן מזרקה של 0.45 µm עם קישוריות חלבון נמוכה (PES או PVDF).
3. הוסיפו תמיסת 5x polyethylene glycol 6000 למצע (הריכוז הסופי צריך להיות 8% polyethylene glycol 6000 ו-0.3 M NaCl). ערבבו על ידי הפיכת המבחנה מספר פעמים (אין להשתמש בוורטקס). דגרו את תמיסת ה-polyethylene glycol המכילה את הנגיף ב-4 °C למשך 12 שעות או יותר, תוך ערבוב מדי פעם.
4. (יום 9) צנטריגו את תמיסת ה-polyethylene glycol המכילה את הנגיף ב-2,500 x g למשך 45 min. הסירו והשליכו את העל-נוזל וסובבו שוב למשך 2 min. שוב, הסירו והשליכו את העל-נוזל.
5. השעיו את המשקע (pellet) על ידי הוספת 320 µl של תמיסת סליין פוספטית סטרילית (PBS) (הנפח של 320 µl הוא 1/100 מהנפח המקורי של המצע הוויראלי שנאסף) ודגרו למשך לילה ב-4 °C. באופן רבבי, ניתן להשעות את המשקע בטמפרטורת החדר על רוקר למשך 30 min.
6. לאחר השעיית המשקע, חלקו את הנגיף לאליקוואות (5-10 µl לכל מבחנה של 0.5 ml) והקפיאו את האליקוואות ב-80 °C- (הפשרה או אחסון ב-4 °C יפחיתו באופן דרמטי את הטיטר).
7. קבעו את טיטר הנגיפים באמצעות פרוטוקולים סטנדרטיים, כלומר, בצעו סדרת דילול בלוחית של 6 בארות עם תאי HEK293T וספרו ידנית מושבות פלורסצנטיות לאחר 48 hr.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
רשימת ריאגנטים לטרנספקציה
מבחנות פוליסטירן 5 ml	Fisher Scientific	352054
polyethylene glycol 6000 (PEG 6000)	Millipore	528877
(10x) Phosphate Buffered Saline (PBS)	National Diagnostics	CL-253
מבחנות מיקרוצנטריפוגה 0.5 ml	USA Scientific	1605-0000
Matrigel	Fisher Scientific	CB-40230A