הערכת מערכת כיסוי נוזלית לבדיקות פלאקים נגיפיים

תקציר

מקור: .Baer, A. and Kehn-Hall, K. קביעת ריכוז נגיפי באמצעות בדיקות פלאק: שימוש במערכות כיסוי מסורתיות וחדשניות J. Vis. Exp. (2014).

סרטון זה מדגים את השימוש בשכבת כיסוי נוזלית מבוססת תאית מיקרוקריסטלית בבדיקת פלאקים, על ידי השוואת יעילותה ביצירת פלאקים נגיפיים לעומת שכבת כיסוי מסורתית של אגרוז חצי-מוצק.

פרוטוקול

1. הכנת תאים וריאגנטים

1. ביום שלפני הניסוי, הזריעו תאים מארחים מתאימים לנגיף הנדון (טבלה 1 ו- טבלה 2(בריכוז של 90–100% confluent)
2. הכן תמיסת קיבוע של 10% פורמלדהיד ב-H₂לדוגמה, ערבבו 5.56 מ"ל של פורמאלדהיד 36% עם 14.44 מ"ל של מים מזוקקים H₂O (dH₂O)₂O)
   הערה: השתמשו בתactices טיפול ו compulsory מתאימות ובהשאה מתאימה בעת שימוש בפורמאלדהיד.
3. הכן את ניגון הקריסטל ויוולט: 1% קריסטל ויוולט (CV) ב-20% אתנול ו-dH₂O.
4. הכן מדיום פסיגות 2x (תלוי בסוג התא, בריכוז 2x; ראה טבלה 2). סנן באמצעות 0.2 µm סנן אם יש חומרים שאינם סטריליים.
5. הכנה של שכבת כיסוי מייצבת (Overlays)טבלה 3)
   1. עבור כיסויים נוזליים, הכינו תמיסה סטרילית של 2.4% אביסל במים מזוקקים₂O. כדי למנוע התקבצות, הוסיפו את האבקה לבקבוק המכיל מים שנעירים במהירות בעזרת מוט עירור, ורסקו את אביסל לאט תוך עירור מהיר בטמפרטורת החדר (RT). כאשר הפתרון נעשה צמיג מדי מכדי שמוט עירור יצליח להומגניז אותו, עברו לערבל בקבוק. >30 דקות עם ערבוב עז כדי להבטיח הומוגניזציה אחידה.
      הערה: ניתן להכין תמיסות מלאי בריכוזים נמוכים יותר, אך ייתכן שהתמיסות יתפצלו וידרשו ערבוב חוזר כדי להבטיח הומוגניות. ניתן להשתמש בתמיסות עבודה של אביסל בטווח של 0.6-3%.
   2. לאחר הומוגניזציה, אוטוקלב את הפתרון ושמור אותו חתום בטמפרטורת החדר.
   3. עבור שכבות חיפוי של אגרוז וקרבוקסימתיל צלולוז (CMC), הכינו תמיסת מלאי ב-dH₂0 של 2% CMC או 0.6% אגרוז. ערבב בעזרת מוט מגנטי ולאן בע autoclave או במיקרוגל כדי להביא לפתרון.

2. עיבויים ודימויים

1. ביום שלאחר הזרעה, בדקו ויזואלית את ריכבות והתahrenות התאים לפני תחילת הניסוי. ודאו את המורפולוגיה התאית הסטנדרטית ואת נוכחותו של שכבת חד-שכבה בריכבות של כ-90%.
2. בצעו פיזור עשרוני סדרתי של הדגימות המודבקות. השתמשו בתווך גדילה תאי לצורך ריבוי ויראלי כמפחית (טבלה 2). שנו את מספר הפיזורים הנדרשים בהתאם לריכוז הצפוי של הנגיף הנדון, ותמיד השתמשו במדגם בקרה לא מודבק כדי להבטיח באופן עצמאי את התahrenות התאים ולסייע בזיהוי פסיגות.
3. מהפיזורים הסדרתיים, הדביקו את התאים למשך 45 דקות עד שעה אחת (טבלה 1). השתמשו בנפח מספיק של החומר המדביק כדי לכסות את התאים, תוך שמירה על נפח נמוך ככל האפשר כדי למקסם את המגע של הנגיף עם השכבה החד-שכבית (טבלה 4). נוערו את הצלחות בזהירות כל 20 דקות כדי להבטיח כיסוי אחיד ולמנוע ייבוש של השכבה החד-שכבית.
4. לאחר ההדבקה, הוסיפו נפח מתאים של תווך מייצב ישירות על החומרים המדביקים בתה (טבלה 2) באמצעות ערבוב ביחס 1:1 של תווך פסיגות 2x עם תווך המייצב הנבחר (CMC, אגרוז או Avicel). נוערו בזהירות כדי לערבב.
   1. עבור תווך מוצף נוזלי, ערבבו ביחס 1:1 תווך פסיגות 2x חמום עם מאגר Avicel 1.2 - 2.4% בטמפרטורת החדר כדי להשיג תמיסת עבודה של 0.6-1.2% Avicel.
   2. עבור מוצף אגרוז, השתמשו בתערובת 1:1 של תווך פסיגות 2x חמום ותמיסת מאגר של אגרוז 0.6% מחומם, והניחו באמבטייה של 56 °C למשך 30 דקות כדי לאזן את הטמפרטורה, והשיגו ריכוז סופי של 0.3% אגרוז/מוצף.
   3. עבור CMC, הכינו תמיסת מאגר של 2% ועבדו עליה כפי שמתואר עבור מוצף האגרוז.
   4. בעת הוספת המוצף על השכבה החד-שכבית, יש תמיד לאזן אגרוז או CMC חמים באמבטייה של 56 °C כדי למנוע נזק לשכבה החד-שכבית. ודאו שהתמיסה חמה אך לא חמה למגע, כדי למנוע מוות תאי וצמצום בריכוזי הנגיף. מרבית מוצפי האגרוז יתחילו להתקשות מתחת ל-42 °C, לכן עבדו במהירות ו/או הכינו כמויות קטנות כדי למנוע התקשות במהלך הטיפול.
5. לאחר הוספת המוצף, הגדילו את הצלחות כדי ליצור פסיגות בודדות שיתאפשר לספורן בבירור. היווצרות הפסיגות עשויה להימשך 2–14 ימים, בהתאם לנגיף שנבחן (טבלה 1).
   הערה: לאחר שהצלחות עם מוצף נוזלי הוכנו, אין להזיזן. הזזת מוצפים נוזליים במהלך תקופת ההתפתחות תגרום לפסיגות מטושטשות. מוצפי אגרוז ו-CMC הם חצי מוצקים וניתן להזיזם או לבדוקם באופן מחזורי תחת מיקרוסקופ אור כדי לעקוב אחר התפתחות הפסיגות.

3. קיבוע וצביעה של תאים

1. כדי לקבע את התאים, שפכו או סרקו את שכבת ה-Avicel, ותקבעו את התאים באמצעות פתרון פורמלדהיד 10% למשך 30 דקות עד למשך לילה (<1 מ"ל לכל באר בצלחת 6 בארות).
   1. עבור אגרוז או CMC, הוסיפו ישירות את פתרון הפורמלדהיד על השכבה למשך שעה עד לילה.
      הערה: ניתן לשמור את הדגימות לתקופות ארוכות בתמיסת הקיבוע, כל עוד היא לא מתאדת ויובשת, שכן מצב זה עלול לעוות את השכבה החד-שכבות.
2. לפני הצביעה ואחרי הקיבוע, הסירו את הפורמלדהיד והסירו את הגושים חצי המוצקים של אגרוז או CMC באמצעות מים זורמים או ידנית בעזרת סכין. שטפו את נגעי ה-Avicel במים כדי להסיר שאריות של השכבה או של תמיסת הקיבוע לפני הצביעה.
3. לצורך צביעה, כסו את התאים בכמות מינימלית של פתרון קריסטל ויולט למשך כ-15 דקות. נוערו את הצלחות במידת הצורך כדי להבטיח כיסוי אחיד.
4. שטו בזהירות את צביעת הקריסטל ויולט במים. לאחר הקיבוע, הצביעה והייבוש, ניתן לאחסן את הנגעים לנצח לצורך ניתוח עתידי.

טבלה 1. תנאי הזרעה ונאות תאים בבדיקת פסיגות

	RVFV	VEEV	אינפלואנזה B
סוג תאים	Vero	Vero	MDCK
תקופת זיהום	1 שעה	1 שעה	45 דקות
זמן אינקובציה	3 ימים	2 ימים	3 ימים

 

טבלה 2. מדיה לגדילה ויצירת פסיגות ויראליות/תאיות

	RVFV	VEEV	שפעת B
סוג תאים	Vero	Vero	MDCK
סוג צמיחה	DMEM1	DMEM1	DMEM2
תווך ליצירת פסיגות	2xEMEMA	2xEMEMA	2xEMEMB

1. מדיום איגל המותאם של דולבקו, משובח ב-10% סרום עגלות עובריות, 1% L-גלוטמין, 1% פניסילין/סטרפטומיצין.

2. מדיום אייגל המודifié של דולבקו, משובח ב-1% L-גלוטמין, 1% פניסילין/סטרפטומייצין, 0.2% אלבומין סרום בקר, 0.025% HEPES, DEAE-דextran 50 מ"ג/מ"ל.

א. 2x מדיה מינימלית imprescית (500 מ"ל) עם 5% FBS (25 מ"ל), 1% חומצות אמינו מינימליות imprescיות (5 מ"ל), 1% פירובט נתרן (5 מ"ל), 1% L-גלוטמין (5 מ"ל), 2% פניצילין/סטרפטומיצין (10 מ"ל).

ב'. 2x מדיה מינימלית imprescית (500 מ"ל) עם 0.2% אלבומין סרום בקר, 1% חומצות אמינו מינימליות imprescיות (5 מ"ל), 50 מיקרוגרם/מ"ל, 0.025% HEPES, DEAE-דextran, Trypsin-TPCK*

*לפני ההכנה, הוסיפו 1 µl ל-25 מ"ל של מאגר TPCK-Trypsin בריכוז 2 µg/ml לחלקת המحلول שתשתמשו בה כדי לערבב עם אגרוז ליצירת פסיגות.

טבלה 3. תחתיות מאגר

	RVFV	VEEV	שפעת B
סוג תאים	Vero	Vero	MDCK
תקופת זיהום	1 שעה	1 שעה	45 דקות
זמן אינקובציה	3 ימים	2 ימים	3 ימים

 

טבלה 4. פורמטים של צלחות

	6 בתים	12 בתים	96 בתים
מספר תאים/בית	5 x 105	2.5 x 105	3 x 104
נפח הנוזל המופרח (μl)	400	200	50
נפח הצעיף (ml)	3	1.5	0.100

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
Crystal violet	Sigma Aldritch	C3886-25G
תמיסת פורמלהיד	Sigma Aldritch	F8775-500ml
Avicel RC-591 NF	FMC BioPolymer USA	RC-591 NF	יש לנער בעוצמה בזמן השחזור למשך >30 min כדי להומוגניзировать
UltraPure agarose	Invitrogen	16500-100
Carboxymethyl cellulose, מלח נתרן, צמיגות בינונית	Sigma Aldrich	C4888