שיטות הדמיה של פליטת אור זיהומים חיידקיים בבעלי חיים החיים המתוארים. פתוגנים הם שונה להביע בלוציפראז הדמיה אופטית המאפשרת לגוף שלם של זיהומים בבעלי חיים. במודלים של בעלי חיים יכול להיות נגוע פתוגנים להביע בלוציפראז ואת כמובן כתוצאה של המחלה דמיינו בזמן אמת על ידי הדמיה פליטת אור.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
שימוש בלוציפראז לזיהומים חיידקיים תמונה ב עכברים
במאמר זה
סיכום
תקציר
הדמיה היא טכניקה ערך שיכולים לשמש כדי לפקח על תהליכים ביולוגיים. בפרט, נוכחות של תאים סרטניים, בתאי גזע, סוגי תאים חיסוניים ספציפיים, פתוגנים נגיפיים, טפילים וחיידקים ניתן בעקבות בזמן אמת תוך חיים בעלי חיים 1-2. יישום של הדמיה פליטת אור ללימוד פתוגנים יש יתרונות לעומת אסטרטגיות לניתוח קונבנציונלי של זיהומים במודלים של בעלי חיים 3-4. זיהומים ניתן דמיינו בתוך חיות אדם לאורך זמן, ללא צורך המתת חסד כדי לקבוע את המיקום והכמות של הפתוגן. הדמיה אופטית המאפשרת בחינה מקיפה של כל רקמות ואיברים, ולא דגימה של אתרים ידועים בעבר להיות נגועים. בנוסף, הדיוק של חיסון לתוך רקמות ספציפיות ניתן לקבוע ישירות לפני ביצוע חיות קדימה שהיו מחוסן הצלחה לאורך הניסוי כולו. השוני בין בעלי החיים יכול להיות נשלט, מאחר הדמיה מאפשר לכל בעל חיים אחר להיות בנפרד. הדמיה יש פוטנציאל לצמצם במידה ניכרת את מספר בעלי החיים הדרושים בגלל היכולת לקבל נתונים מנקודות זמן רב מבלי מדגם רקמות כדי לקבוע 3-4 לטעון הפתוגן.
פרוטוקול זה מתאר שיטות לדמיין זיהומים בבעלי חיים באמצעות דימות של פליטת אור רקומביננטי זנים של חיידקים להביע בלוציפראז. החיפושית לחץ (CBRLuc) ו luciferases גחלילית (FFluc) לנצל luciferin כמו מצע 5-6. האור המיוצר על ידי שתי CBRluc ו FFluc יש אורך גל רחב של nm 500-700 ננומטר, מה שהופך את אלה luciferases כתבים מעולה עבור דימות אופטי במודלים של בעלי חיים החיים 7-9. זה בעיקר בגלל אורכי הגל של האור יותר מאשר 600 ננומטר נדרשים כדי למנוע ספיגה של המוגלובין, ולכן עוברים דרך רקמות יונקים ביעילות. בלוציפראז הוא הציג גנטית לתוך חיידקים כדי לייצר אות אור 10. עכברים הם ריאתי מחוסן עם חיידקים bioluminescent intratracheally לאפשר ניטור של זיהומים בזמן אמת. לאחר הזרקת luciferin, תמונות נרכשים באמצעות מערכת דימות IVIS. במהלך הדמיה, עכברים מורדמים עם isoflurane באמצעות XGI-8 מערכת Anethesia גז. דמויות יכולות להיות מנותח למקם ולכמת את מקור האות, המייצגת את אתר זיהום חיידקי (ים) ומספר, בהתאמה. לאחר הדמיה, נחישות CFU מתבצעת על רקמת הומוגני כדי לאשר את קיומו של החיידק. כמה מנות של חיידקים המשמשים לקשר בין מספרי חיידקים עם הארה. הדמיה ניתן ליישם מחקר של הפתוגנזה והערכה של יעילות של תרכובות וחיסונים אנטיבקטריאלי.
פרוטוקול
1. זיהום ריאתי ידי אינטובציה Intratracheal
- לשקול עכברים, אופציונלי, סימני יכול להתבצע על האוזניים לזיהוי קל.
- להרדים את העכברים עם קטמין (100 מיקרוגרם לכל גרם של משקל העכבר) ו xylazine (10 מיקרוגרם לכל גרם של משקל העכבר) על ידי חיסון intraperitoneal.
- המקום עכברים בכלובים עד בהרדמה מלאה. לסחוט את כריות רגליהם כדי לבדוק דוושת רפלקס. עכברים צריך להציג מופחת או ללא תגובת רפלקס.
- מניחים את העכבר על....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
למרות הבאים הפרוטוקולים הללו יהיו בדרך כלל תוצאה של תמונות באיכות גבוהה, חשוב לשקול כמה נושאים מרכזיים על מנת לקבל נתונים מדויקים ועקביים של לימודי הדמיה. תמונות הארה יש רכשה כי יש ספירת 600 מתוך 60,000 כדי להבטיח כי האות מעל הרקע ואת המצלמה לא רווי. אם האות המתקבל הוא פחות מ 600 בתנאי החשיפה צריך להיות מותאם כדי להגדיל שחשוב. אם האות המתקבל הוא מעל 60,000 המצלמה רווי באזורים מסוימים. כאשר המצלמה רווי, כימות לא צריך להיות ניסיון באזורים רווי, למרות שזה עדיין אפשרי והכרחי לעתים בלת.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
מחקרים שנעשו בבעלי חיים בוצעו בהתאם להנחיות והתקנות שנקבעו על ידי טיפול בבעלי חיים מוסדיים ועדת שימוש טקסס A & M האוניברסיטה.
תודות
המחברים מודים מעבדה חברי צ'ירילו לדיונים בעלי ערך וסיוע לאורך כל תקופת המחקר הזה. אנו מודים לד"ר יהושע היל המעבדה של ד"ר ג'יימס סמואל לקבלת סיוע במהלך הסרטה של פרוטוקול זה. עבודה זו מומנה על ידי מענק של 48,523 ביל ומלינדה גייטס ולהעניק AI47866 מן המכונים הלאומיים לבריאות.
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| איזופלוראן | VETONE | 501027 | |
| קטמין | Butler Animal Health Supply | ||
| קסילזין | MP Biomedicals | 158307 | |
| לוסיפרין | GMT | LUCK-100 | |
| תמיסת Fetal plus | Vortech Pharmaceutical Ls, Ltd | ||
| קתטר (22G x 1")”) | Terumo Medical Corp. | OX2225CA | |
| חוט מוליך | Hallowell EMC | 210A3491 | |
| אוקטוסקופ עם ספקולום | Hallowell EMC | 000A3748 | |
| מערכת Xenogen IVIS | Caliper Life Sciences | ||
| מערכת הרדמה XGI-8-gas | Caliper Life Sciences | ||
| תוכנה לדימוי חי (Living Imaging) | Caliper Life Sciences | ||
| קונוסי אף שקופים | Caliper Life Sciences | ||
| מחיצת הסתרה של אור | Caliper Life Sciences |
מקורות
- Wilson, T., Hastings, J. W. Bioluminescence. Annu Rev Cell Dev Biol. 14, 197-230 (1998).
- Contag, C. H., Bachmann, M. H. Advances in in vivo bioluminescence imaging of gene expression. Annu Rev Biomed Eng. 4, 235-260 (2002).
- Hutchens, M., Luker, G. D.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
