דחיית רקע הקרינה תהודה ו microspectroscopy ראמאן ספונטנית

סיכום

אנחנו דנים הקמה ותפעול של מערכת מורכבת אופטית לא לינארית המשתמשת מיתוג מהירים כל אופטי לבודד ראמאן אותות הקרינה. באמצעות מערכת זו אנו מסוגלים להפריד בהצלחה אותות רמן הקרינה ניצול אנרגיות וכוחות הדופק הממוצע להישאר בטוחים מבחינה ביולוגית.

תקציר

ספקטרוסקופיית ראמאן היא סובלת לעתים קרובות על ידי רקע פלורסנט חזקה, במיוחד עבור דגימות ביולוגיות. אם המדגם הוא נרגש עם רכבת של פולסים מהירים, מערכת שיכולה temporally נפרד spectrally חופפים אותות על picosecond זמנים יכולים לבודד מיד מגיע אור מפוזר ראמאן מן האור המגיע מאוחר פלואורסצנטי. כאן אנו דנים, הקמה ותפעול של מערכת מורכבת אופטית לא לינארית העושה שימוש כל אופטי מיתוג בצורה של צריכת חשמל נמוכה אופטי קר השער לבודד את האותות רמן פלואורסצנטי. לייזר יחיד 808 ננומטר עם 2.4 וואט בממוצע ו 80 חזרות בקצב MHz מפוצלת, עם mW כ 200 של אור 808 ננומטר להיות מומר 5 mW <אור 404 ננומטר נשלח המדגם לרגש פיזור ראמאן. הנותרים unconverted אור 808 ננומטר לאחר מכן נשלחת בינוני קוי בו מעשים כמו משאבת עבור תריס כל אופטי. תריס נפתח ונסגר ב fs 800 עם יעילות שיא של כ -5%. באמצעות מערכת זו אנו מסוגלים להפריד בהצלחה אותות רמן הקרינה על שיעור 80 MHz החזרה באמצעות אנרגיות וכוחות הדופק הממוצע להישאר בטוחים מבחינה ביולוגית. כיוון שהמערכת אין לקיבולת במונחים של כוח אופטי, אנחנו מספר שיקולים פרט לעיצוב ויישור המסייעים למקסם את התפוקה של המערכת. כמו כן, אנו דנים פרוטוקול שלנו להשגת חפיפה במרחב ובזמן של האות וקורות המשאבה בתוך המדיום קר, כמו גם פרוטוקול מפורט לרכישת ספקטרלי. לבסוף, אנו דו"ח תוצאות נציג כמה ספקטרום ראמאן שהושג בנוכחות הקרינה חזקה באמצעות מערכת זמן gating שלנו.

פרוטוקול

1. הטיפול חייב להילקח חלק בהכנת והנחת מדגם ראמאן בתוך המערכת הזאת.

1. כיוון שהמערכת בדרך כלל עושה שימוש מאוד גבוה מטרות הצמצם המספרי עם מרחקים עבודה קצר מאוד, דגימות ממוקמים על coverslip. דגימות ביולוגיות מונחות בדרך כלל על coverslip 1 עובי מספר רכוב בתא תא Attofluor (Invitrogen, בקרלסבד, קליפורניה).
2. דגימות נוזלי, במיוחד אלה רעילים לבני אדם, ממוקמות בתוך בקבוק זכוכית קטן עם coverslip ביצרו לפתיחת באמצעות אפוקסי סיליקון. הבקבוק הוא הפוך אז למדידה.
3. מכיוון שהמערכת שלנו תלויה בתזמון מדויק של המשאבה וקטניות האות, אנחנו מוגבלים לא להשתמש הסתגלות להתמקד קונבנציונאלי של המיקרוסקופ שלנו, המתרגמת את המטרה למעלה ולמטה. זה מוסיף גורע נתיב אופטי מהמערכת שלנו. במקום זאת, אנו מקום דגימות שלנו על הבמה המשנית רכוב על גבי הבמה מיקרוסקופ כי יש להתמקד שליטה עצמאית משלו.

2. על מנת לקחת זמן מגודרת ספקטרום ראמאן, הקורה עירור צריכים להיות מוכנים כראוי.

1. אנחנו מתחילים עם האור העולה מתוך 2.4 W מתכונן פעמו טי: Sapph לייזר (Chameleon, מערכות קוהרנטית, סנטה קלרה, קליפורניה). כל הדופק הרכבת 80 הדופק MHz יש 30 NJ של אנרגיה, יש רוחב הזמני של fs 140, ויש לו מגוון מרוכז ב 808 ננומטר עם רוחב פס רפאים של ~ 6 ננומטר.
2. כדי למנוע חזרה מ-השתקפויות מחדש את חלל הכניסה הלייזר, האור עובר דרך המבודד פאראדיי. צלחת חצי גל להציב לפני המבודד פאראדיי מאפשרת כוונון רציף מכלל כוח שנשלח לתוך המערכת.
3. כי 6 ננומטר הוא רחב מדי רוחב פס כדי לפתור מצבים ראמאן ביותר, קרן נשלחת דרך פילטר (0.8 ננומטר FWHM, אנדובר Corporation, סאלם, NH) צר מאוד bandpass מרוכז ב 808 ננומטר.
4. האור ממוקדת מכן על ידי כפיל אכרומטי (f = 100 מ"מ) על borate β-בריום 5 מ"מ (BBO) קריסטל (CASIX, פוז 'ו, Fujian, סין יח"צ) לקצץ בחצי את אורך הגל של nm 808-404 ננומטר. גביש BBO ממוקם הר עם פקדי קצה ו להטות, ועלה גם על הבמה תרגום. כדי למקסם את יעילות ההמרה גל, גביש חייבים להיות ממוקמים בדיוק סימטרי על הפוקוס של כפיל, ועם ציר קריסטל שלה מיושר הקיטוב של הקרן הנכנסת.
5. בגלל יעילות ההמרה של אורך הגל הוא תלויי קיטוב, שליטה על כמות האור נשלח המדגם ניתן להשיג על ידי הנחת צלחת חצי שנייה אחרי גל המבודד פאראדיי. על ידי החלפה זו waveplate, עוצמת האור נשלח המדגם יכול להיות מותאם באופן בלתי תלוי בעוצמת נשלח הקורה משאבה (שיידונו להלן).
6. גל המרה האור הוא recollimated ידי כפיל אכרומטי השני (f = 500 מ"מ) נבחר כך הקורה היציאה הוא גדול מספיק כדי למלא את הצמצם חזרה המטרה מיקרוסקופ, וביים לתוך מיקרוסקופ הפוכה (IX-71, אולימפוס, מרכז עמק, PA) באמצעות שתי מראות ההיגוי.
7. מטרת מיקרוסקופ, להיות אלמנט אופטי שוכן בתוך רכיב מונוליטי ביותר של המערכת, מגדיר את ציר הראייה. כדי ליישר את הקורה עירור על הציר הזה, מראה ממוקם המטוס מדגם של המיקרוסקופ. שתי מראות ההיגוי הם אז מכוון iteratively תוך שמירה על גב משתקף קרן לייזר על מצלמת CCD-ERA (μEye, IDS, Obersulm, גרמניה) המחובר ליציאה הדמיה של המיקרוסקופ. בהנחה התמונה על המצלמה מתמקדת מיקרוסקופ שדה של נוף, הקורה על ציר כאשר את המקום מוקד מרוכז על השבב מיקרוסקופ ותרגום המטרה לאורך ציר Z-אינו משנה את נקודת המרכז הקורה ממוקד.
8. כאשר דגימת ממוקם המטוס מדגם מוקרן עם פיזור אור לייזר ראמאן מתרחשת. מסנן dichroic הניח מתחת למיקרוסקופ המטרה מפריד את אורך הגל, העביר אור מפוזר ראמאן (ו פלואורסצנטי) מן הקורה עירור, לכוון את אור מפוזר ראמאן לנמל בצד של המיקרוסקופ. המיקרוסקופ שונה כדי להסיר עדשות בתוך הנתיב הזה, כך עולה מן האור האות המיקרוסקופ collimated.
9. מכיוון קרן אות העולה מתוך המיקרוסקופ הוא גדול יותר מאשר הצמצם ברורה של מקטבים Glan-תומפסון, טלסקופ 0.47x בנוי משני כפילויות אכרומטי (F1 = 75 מ"מ, F2 = 35 מ"מ) משמש כדי לכווץ את הקורה.
10. אור מקוטב האות מכן על ידי מקטב Glan-תומפסון בכיוון ב 0 ° ביחס אנכי בתוך מסגרת במעבדה, וניהל למראה dichroic שבו הוא recombined עם קרן המשאבה.

3. על מנת השער האופטי כדי לפעול ביעילות שיא, יש להקפיד בהכנת הקורה משאבה (קר קרן) וכן.

הדופק המשאבה מוגדל הראשון עם טלסקופ בנוי עם שתי כפילויות אכרומטי (F1 = 35 מ"מ, F2 = 100 מ"מ) כדי להתאים את גודלו הסופי של קרן את האות על ידי 0.35x.
1. קרן המשאבה לאחר מכן נשלחת לקו עיכוב מורכבת פריזמה זווית ישרה להציב על הבמה תרגום ליניארי כי יכול להיות מכוון, כדי להבטיח חפיפה הזמני של המשאבה וקטניות אות (כוונון שיידונו להלן).
2. אחרי שורת עיכובים, קרן נשלחת באמצעות צלחת חצי גל ו מקטב בכיוון ב 45 ° ביחס אנכי בתוך מסגרת מעבדה. זה מבטיח את מצב הקיטוב הנכון של קרן המשאבה כאשר הוא מגיע בינוני קוי.
3. האור משתקף אז את ההיגוי של שתי מראות, אחת עם piezo חשמלי שולטת, המשמשים דק להתאים את המיקום של הקורה משאבה כזאת שהיא חופפת מרחבית עם קרן את האות. חפיפה מתקבל על ידי התבוננות המשאבה ואת הקורות אות בשני מקומות, אחד קרוב אחד רחוק מן המראה dichroic שבו קורות משולבים. באמצעות המראה ההיגוי הראשון חפיפה שתי הקורות בשלב הקרוב, את המראה piezo חפיפה קורות בנקודה רחוקה, קרן המשאבה יכול להתבצע בדיוק קוליניארי עם קרן את האות.
4. עם שתי הקורות גם יחד, השער קר ומערכת איסוף מוגדרים על מנת למקסם את הזמן מגודרת שנאספו האות.

4. עם שתי הקורות גם יחד, השער קר ומערכת איסוף מוגדרים על מנת למקסם את הזמן מגודרת שנאספו האות.

1. קורות המשאבה ואת האות הם עברו תחילה דרך פילטר dichroic כי יש מנת יתר של 6 ב 404 ננומטר למנוע אור עירור שיורית מתוך פיזור ראמאן מרגש בתוך המדיום ליניארית.
2. המשאבה וקורות אות ואז הם שניהם התמקדו על ידי כפיל אכרומטי (f = 35 מ"מ) לתוך קובט 1 ס"מ pathlength קוורץ המכיל את החומר ליניארית. כל חומר בעל קוי מדד כראוי קוי גבוה (גבוה מ CS _2), בתגובה הזמני קצר כראוי (<2 ps), יכול להיות מנוצל כאן. בניסויים אלה, אנו משתמשים פחמן דיסולפיד, CS _2, כי יש מדד קוי n ₂ = 3.1 x 10 ^-18 מ ^'2 / W. האור recollimated מכן על ידי כפיל שנייה עם אורך מוקד זהה לראשון.
3. הקורות הם עברו אז דרך Glan-תומפסון מנתח על הר מסתובב, ולאחר מכן באמצעות מערכת של מסנני קליטה הפרעה בשילוב יש OD של 10 ב 808 ננומטר.
4. לבסוף, לאור אות הוא התמקד על ידי כפיל אכרומטי (f = 35 מ"מ) לתוך סיב אופטי multimode 50 מיקרומטר, כאשר הוא רכוב סיבים בשלב המאפשר תרגום x, y, וז' סיבים מצמידים מכן הספקטרוגרף הדמיה מסחרי עם המצורפת מצלמת CCD (SP2300i ו Pixis 100B, בהתאמה, שניהם מיוצרים על ידי פרינסטון מכשירים, טרנטון, ניו ג'רזי).
5. כדי ליישר את מערכת איסוף על מנת למקסם את האות שנאספו, הנתח הוא 0 ° ו מדגם הבדיקה של טולואן ממוקם המטוס מדגם. על ידי התאמת x, y, z בקרות ההר סיבים, האות ראמאן נאסף הוא מותאם.
6. כדי להבטיח חפיפה במרחב ובזמן הנכון של המשאבה וקורות האות, מראה ממוקם המטוס מדגם של המיקרוסקופ. המסנן 404 ננומטר הוא הסיר מהמערכת. עם הנתח כדי לסובב 90 ° ננומטר retroreflected קרן 404 נשלח אל הספקטרוגרף עם עוצמת מותאם כאלה שזה לא להרוות את המצלמה. עם הקורה משאבת כבוי, הנתח הוא הסתובב כדי למזער ננומטר האות המועבר 404. עם קרן משאבת חזר על, בשלב עיכוב מכוון לאט עד לסיום השידור של אור 404 ננומטר מתחיל לעלות. ואז, על ידי iteratively כוונון השלב דיחוי, את המראה piezo חשמלי, ואת x, y, z בקרות של סיבים, אחד ממקסם את האות.
7. מכיוון רטרו משתקף 404 ננומטר קרן אור מפוזר ראמאן עשוי להימשך נתיבים שונים במקצת באמצעות המערכת, התאמות הסופי מבוצעים על ידי הצבת חזק ראמאן scatterer (כגון טולואן) על הבמה מדגם ואת tweaking מעט יישור על ידי שינוי שלב עיכוב, piezeo חשמלי במראה, ו-x, Y ו-Z שולט של סיבים כדי לייעל את האות ראמאן.

5. אוסף של ספקטרום זמן מגודרת אחת ראמאן דורש רכישת ספקטרום כמה לתקן חפצים המערכת.

1. עם הנתח מוגדר 0 °, קרן עירור על הקורה ואת משאבת כבוי, ספקטרום "ungated" היא נלקחה, המייצגים את הקשת זה יהיה רכש ללא היתרון של מערכת זמן gating.
2. עם הנתח מוגדר ° 90, את קרן עירור ואת קרן משאבת עדיין כבוי, ספקטרום גב הקרקע נלקחת, המייצג את כמות האור תועה דולף דרך מקטבים ורכיבים אחרים במערכת.
3. עם הנתח הנותר על 90 °וכל הקורות על, את הספקטרום "מגודרת" היא נלקחה, המייצג את אור מפוזר ראמאן מותר דרך מקטבים חצו על ידי נוכחות של הקורה המשאבה.
4. לבסוף, עם הנתח עדיין 90 °, הקורה עירור לסירוגין את קרן על המשאבה, ספקטרום הרקע השני הוא נלקח, המייצג את התרומה הספקטרום "מגודרת" כמויות שיורית של אור 808 ננומטר נכנסים הספקטרוגרף.
5. בנוסף, קשת נלקח עם כל לייזרים כבוי, המאפיינת את הבסיס האות "כהה" ברמה של המצלמה ואלקטרוניקה.
6. בגלל הספקטרום לעיתים קרובות דורשים פעמים אינטגרציה ארוך, הכרחי לשבור הפעם להשתלבות כמה חתיכות (מסגרות), כדי לאפשר תיקון נאותה של קרניים קוסמיות - בעיה נפוצה כאשר רכישת נתונים על תוחלת של מספר דקות.

6. רכשה פעם, מדרגות עיבוד כמה מועילים כדי לשפר את האיכות והמראה של הנתונים.

1. ראשית, כל הספקטרום מתוקנות כהה על ידי הפחתת את ספקטרום "כהה".
2. כדי לתקן את הקרניים הקוסמיות, המסגרות מספר המהווה one רכישת מושווים זה לזה על בסיס פיקסל אחר פיקסל. עבור כל פיקסל של מסגרת כלשהי נופל החוצה של 2 סטיות חציון מהערך החציוני פיקסל כי על פני כל המסגרות, ערך של פיקסל מוחלף על ידי הערך החציוני על פני כל המסגרות.
3. מסגרות הקרינה הקוסמית תיקן הם ממוצעים אז והחליקה על ידי מסנן Savitzky-Golay ^1.
4. כדי לחלץ את ספקטרום "נכון" מגודרת, אנו לנכות את "עירור בלבד" ו "משאבת בלבד" ספקטרה מן הספקטרום נמדד מגודרת.
5. לבסוף, ספקטרה מגודרת ו ungated אז הם הרקע לתיקון על ידי הפחתת 5 ^th סדר פולינום, נקבע בשיטה של ליבר Mahadevan ו-Jansen ^2.

7. נציג תוצאות:

באיור 1. תרשים סכמטי של מערכת gating קר. נתיב קרן משאבת מוצג באדום, ואילו נתיב SHG מוצג בכחול. הנתיב שבו רמן פלואורסצנטי הן חפפו מוצג בירוק, ואילו הנתיב בו Fluorescence סוננה temporally החוצה מוצג בצהוב. קיצורים כדלקמן: BPF, הלהקה לעבור סינון, CCD, מצמידים מכשיר חיוב; DCM, dichroic במראה; FI, פאראדיי מבודד; λ / 2, גל צלחת וחצי, LPF, ארוך לעבור מסנן: בינוני NLM, קוי, P, מקטב ; SHG, הדור השני הרמוני קריסטל.

איור 2 למעלה:. ספקטרה גולמי של coumarin מומס בשמן טבילה. עקומת האדום מראה את ספקטרום שצולמו עם השער החזיק פתוח (מנתח מערכת להעברת מקסימום). עקומת שחור מראה ספקטרום שצולמו עם הנתח מיושר להעברת מינימום משאבה קרן מיושם (הספקטרום מגודרת). עקומת הכחול מראה את spectum שצולמו עם הנתח מיושר להעברת מינימלית ולא משאבת קרן מיושם (השער החזיק סגור). עקומת גרין מציג את ספקטרום שצולמו רק את הקורה משאבת מיושם. קווים מקווקווים מציינים מגנטה באזור ספקטרלי המוצגים בלוח להלן. כל ספקטרום להיות מוחלק עם נקודה 11, 3 Savitzky-Golay כדי לסנן. למטה: ספקטרה של coumarin מומס בשמן טבילה לאחר הקרינה רקע חיסור. עקומת האדום הוא הספקטרום עם השער החזיק פתוח, עקומת כחול הוא ספקטרום מגודרת. הספקטרום מגודרת מראה בבירור את מאפיין מפותל גבוהה wavenumber שיא של שמנים.

דיון

תחום ספקטרוסקופיית ראמאן ביו ראה עניין גובר בשנים האחרונות כתוצאה פוטנציאל הפגינו שלה לפתרון האתגרים הקשים מספר אבחון ביולוגי. לדוגמה, ספקטרום ראמאן הוכחו יש ערך אבחון סרטן זיהוי ^{3, 4, 5, 6.} ספקטרוסקופיית ראמאן שימש גם ב quantitation חיידקי ^{7, 8} ו ⁹ תגובה התרופה חיידקי. היא מצאה גם יישום מגוון רחב של יישומים ביו אחרים החל בריאות העצם ¹⁰ לניתוח biofluid ^{11, 12.}

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
שם	חברה	מספר קטלוגי	תגובות
עדשות	ThorLabs	שונים	כל עדשות מצופה יש הפסדים השידור המרבי של 1% כל אחד
מתכוונן טי: Sapph לייזר	קוהירנט	זקית	30 ניו ג'רזי, 200 fs, 80 MHz
שמן 40X טבילה אובייקטיבי	אולימפוס	UApo/340	NA = 1.35
הפוך מיקרוסקופ	אולימפוס	IX-71	השתנה כדי להסיר את כל עדשות בנמל צד
חצי צלחת גל	Thorlabs	AHWP05M-600
Glan-תומפסון מקטב	Thorlabs	GTH10M	~ העברת 10% הפסד
ספקטרומטר	PI אקטון	SP2300i
CCD	PI אקטון	Pixis 100B
Mathmatical תוכנה	MathWorks	MATLAB	גרסת 2008a
פאראדיי מבודד	EOT	BB8-י 5
Piezo חשמלי המראה	ניופורט	AG-M100
BBO קריסטל	CASIX	מנהג	1 מ"מ עובי
Bandpass לסנן 1	אנדובר	008FC14	808 ± 0.4 ננומטר
Dichroic במראה	Semrock	FF662-FDI01	הלהקה קצה ב 662 ננומטר
ארוך לעבור סינון	Semrock	BLP01-405R	הלהקה קצה ב 417 ננומטר
Bandpass לסנן 2	Semrock	FF02-447/60	417-447 ננומטר
CS 2	סיגמא אולדריץ	335266	99% טוהר
Coumarin 30	סיגמא אולדריץ	546127	99% טוהר
טבילה שמן	Cargille	16242	סוג DF