הדם עצמיים הזרקה מודל של דימום intracerebral בעכברים המתואר פרוטוקול זה משתמש בטכניקת הזרקה כפולה כדי למזער את הסיכון של ריפלוקס הדם במעלה השביל מחט, אין תרופות נגד קרישת דם במערכת שאיבה, ומונע כל שטח מת צינורות להרחבה במערכת.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
הזרקת דם עצמיים על דגם דימום intracerebral ספונטנית עכברים
במאמר זה
סיכום
תקציר
חקירה של הפתופיזיולוגיה של הפגיעה לאחר דימום תוך-מוחי (ICH) מחייבת מודל בעלי חיים הניתן לשחזור. בעוד ש-ICH מהווה 10-15% מכלל מקרי השבץ, עדיין אין טיפול יעיל ספציפי. מודל הזרקת דם אוטולוגי בעכברים כולל הזרקה סטריאוטקסיקו של דם עורקי אל הגנגליים הבסיסליים (basal ganglia), המדמה דימום היפרטנסיבי ספונטני באדם. ניתן להלביא כך לבחון את התגובה לדימום in vivo ולכמת את הגסורים הנוירו-התנהגותיים, דבר המאפשר תיאור של הפתולוגיה הנובעת מכך ובדיקה של חומרים טיפוליים פוטנציאליים. הפרוצדורה המתוארת בפרוטוקול זה משתמשת בטכניקת הזרקה כפולה כדי למזער את הסיכון לרפלקס של דם לאורך נתיב המחט, ללא נוגדי קרישה במערכת השאיבה, ומבטלת את כל הנפחים המתים (dead space) ואת הצינורות הגמישים במערכת.
פרוטוקול
1. הכנת ציוד
- נגבו את מסגרת משאבת stereotaxic עם אתנול 75% כדי לצמצם זיהום חיידקי.
- לעקר מחט מזרק המילטון סיליקה התמזגו.
הערה: אם עיקור כימי משמש, הקפידו לשטוף מספר פעמים במים סטריליים לפני השימוש. - נגב פני השטח של נייר שעווה פרפין עם אתנול 75% ולאפשר לו להתייבש.
2. הכנת עכבר להזרקה
הערה: יש עכברים נמסר מתקן בעל החיים שלכם לפחות 7 ימים לפני הניתוח כדי לאפשר להם להסתגל לסביבה החדשה להפחית את הלחץ.
- לשקול את העכבר על הבסיס טרום ניתוחית.
- להשרות הרדמה עם חמצן 30%, תחמוצת החנקן ב -70%, ו -4% עד Isoflurane מגיב לצבוט זנב
- הזרק עכבר עם עצירות 0.1mg/kg intraperitoneally על כאבים שלאחר הניתוח
- גילוח הקרקפת
- מעיל עם עיניים סטריליות וזלין
- הכן את הקרקפת בבטאדין x 3 מגבונים, אז לאפשר קרקפת יבש
- ודא 1 חתך קו האמצע ס"מ sagittal של הקרקפת בעזרת איזמל ניתוחים סטרילי
הערה: חתך נדיב יאפשר חשיפה מלאה של ציוני דרך הגולגולת. - שבי 1 ס"מ על פני הגחון של הזנב מתחיל 1 ס"מ מבסיס ולהכין בבטאדין x 3 מגבונים
- המקום העכבר על מסגרת stereotaxic
הערה: חשוב לוודא עכבר מאובטח בתוך מסגרת עם משטח מקביל הגולגולת עם בסיס הפריים, עם חשיפה מצוינת גבחת לפחות 3 מ"מ מימין גבחת.
3. דימום intracerebral ניתוח
הערות: במהלך הניתוח כולו העכבר הוא הרדים עם חמצן 30%, תחמוצת החנקן ב -70%, ו -% 1-3 Isoflurane, שמרו ברציפות ב 37 ± 0.5 מעלות צלזיוס באמצעות thermistor שבשליטת כרית חימום פיקוח על ידי מדחום רקטלי.
- צרף מחט סטרילית 27 גרם על מזרק 1 סמ"ק על מסגרת.
- התאם זרוע stereotaxic עד מחט בדיוק מעל גבחת.
- התאם את הזרוע כך מחט זה ב 2.5 מ"מ לרוחב גבחת התחתון אל פני השטח של הגולגולת.
- לסובב ידנית מזרק לעשות חור בר על פני הגולגולת תוך יישום תנועה כלפי מטה עדין של טיפול מסגרת נטילת לא לגמרי לחרר הגולגולת.
- הסר חור המחט בר להשלים באופן ידני עם מזרק / מחט
הערה: השלמת חור בר ביד המאפשר הכרה מיידית כאשר יש לך מחורר את השולחן הפנימי של הגולגולת ממזער את הסיכון של בשוגג דוחפים מחט לתוך המוח parenchyma. - בצע חתך רוחבי על פני השטח הגחון של הזנב באמצעות להב כירורגי סטרילי ומאפשרים 2-3 טיפות גדולות של דם עורקי ליפול על נייר שעווה פרפין. ואז מהר לעצור את הדימום עם לחץ באמצעות גזה סטרילי.
- משיכה 17 μL דם לתוך המזרק המילטון מזרק מקום על המשאבה.
- התאם זרוע stereotaxic לנקודה 5 ° מדיאלית ביחס לציר האנכי.
- בזהירות להתאים זרוע stereotaxic כך קצה המחט היא מעל החור בר בגולגולת ואז נמוך יותר 3.5 מ"מ מחט.
- חכה 2 דקות ואז למשוך את מחט 0.5 מ"מ (כך טיפ כי הוא עמוק 3 מ"מ)
- המתן 5 דקות, כדי לאפשר למוח מחדש להרחיב סביב המחט ולמזער את הסיכון של דם refluxing את מסלול החדרת המחט במהלך ההזרקה.
- הזרק 1 דם μL / דקה עבור μL 7.5.
- המתן 5 דקות כדי לאפשר קרישת דם ראשוני עבור משמרות רקמות להתרחש כדי למזער עליות בלחץ תוך גולגולתי.
- להזריק את μL הנותרים 7.5 ב μL 1 / דקה
- אפשר מחט להישאר במקום במשך 25 דקות על מנת לאפשר קרישת דם
הערה: אי להמתין קרישת הדם יביא דם refluxing את אתר הכנסת מחט כאשר משיכת המחט - לאט לאט למשוך את המחט מיד לשטוף עם מים חמים כדי למנוע כל הדם שיורית המחט של קרישת להבטיח reusability של מחט.
- הסר את העכבר מהמסגרת ולסגור את הזנב חתכים בקרקפת עם דבק רפואי וטרינרי.
- בטל הרדמה.
- אפשר עכבר להתעורר בעת היותו חימם ברציפות עם גישה חופשית לחלח מזון.
- חזור העכבר לכלוב עם להמלטה כאשר ער לחלוטין. המקום המזון גלולה רטוב על רצפת הכלוב כדי לעזור חיות גישה למזון.
4. נציג התוצאות:
באיור 1. סעיף העטרה של המוח עכבר 15 דקות לאחר הניתוח ICH. מיד לאחר להקריב את המוח נבדק להצלחה ICH מבוסס על בדיקה ברוטו של קטע העטרה באתר החדרת המחט. דימומים כי איתר לבסיס המוח, את המסלול מחט בעבר כפיס המוח, או לתוך החדרים נחשבו מוצלחים וכי עכבר חוסל מן מנתח הכל. בסך הכל ICH succeשיעורי ss היו 75-85% ב 50 עכברים עם תמותה 0%.
איור 2. בדיקות צילינדר מדגים hemiparesis שמאל לאחר ICH זכות הגרעינים הבזליים. (א) העכבר מדגם האחורי לאחר הניתוח ICH. הערה המיקום של forelimb רק זכות על הקיר של הגליל לאחר ICH שמאל הגרעינים הבזליים. (ב) גרף של בדיקות צילינדר 1 תוצאות מקבוצה של עכברים לאחר ניתוח ICH (n = 5) לעומת דמה (n = 4). עכברים שאם היו כל נהלים למעט הזרקת דם (מחט היה מוכנס לתוך המוח). עכבר כל הוצב גליל 12 ס"מ זכוכית שקופה בקוטר נצפו במשך 20 מתנשא. המיקום הראשוני של forelimbs על הקיר של הגליל קלע לכל האחורי. תנועות עוקבות (כגון חקירה לרוחב) לא דורגו עד חזר העכבר אל הקרקע האחורי הבא הבקיע. המדד צדדים היה מחושב (# מיקומים forelimb ימין בצד של גליל - שמאל # מיקומים forelimb) / (# ימין + שמאל + # # שניהם), שבו 0 הצביעו על העדפה forelimb ו 1 הצביעו רק forelimb ימין היה בשימוש .
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
מודל זה כירורגית של דימום intracerebral בעכברים באמצעות עצמיים עורק זנב תוצאות דם מודל לשחזור של דימום ספונטני הגרעינים הבזליים. מודל ICH בעכברים מציע את היתרון של הזמינות של חיות טרנסגניות לחקור פתופיזיולוגיה, אולם גודלם הקטן גורם נהלים נוירוכירורגיים קשה יותר מבחינה טכנית מאשר בעלי חיים גדולים יותר.
המודל collagenase ואת המודל עצמיים הזרקת דם שני ומבוססת דגמים של ICH ניסיוני. בעוד המודל collagenase מציעה הליך ק...
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
אין ניגודי אינטרסים הכריז.
תודות
העבודה מומן על ידי מענק מהמכון לרפואה Translational ותרופות, וכן להעניק הכשרה מהמכון לרפואה הנדסה (T32HL007954) באוניברסיטת פנסילבניה, ל 'מרלן כהן וג'רום ח Fleisch Scholar גרנט ב אוניברסיטת קונטיקט המרכז לבריאות (LHS) ו - NS-NIH 029331 (FAW).
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
מסגרת Stereotaxic לניתוחי מוח העכבר (Stoelting, 51925)
Microinfusion המשאבה ואת המעבד (UMP-3 ו Micro4, מכשירים Precision העולם, סרסוטה, פלורידה)
עכבר חם (Stoelting, 50300)
עכבר הרדמה שאיפת (Braintree Scientific, EZ-AF9000)
25 μL gastight בורוסיליקט המילטון המזרק עם הבוכנה מצופה ולא מחט
(חברת המילטון, רינו, NV, מזרק 1702RN: 765,401, טבעת חזוק: 30949, spacer: 30,946)
מחט סיליקה התמזגו לחתוך באורך 2 ס"מ (המילטון, 17739)
* הערה המילטון מזרק מחט סיליקה התמזגו ניתן לעשות בה שימוש חוזר עבור ניתוחים רבים אם מעוקרים לפני הניתוח כל אחד. חומרים אלה חיוניים כדי למנוע קרישת הדם.
כפפות מנתחים סטרילית
שמלת כירורגי, מצנפת מסכה
בבטאדין
75% אתנול
מחט סטרילית 27 גרם (שימוש יחיד)
מזרק סטרילי 1 סמ"ק (שימוש יחיד)
להב כירורגי סטרילי
Cidex
מים סטריליים
עצירות ו isoflurane
גזה סטרילית
שעוות פרפין נייר משבצות
דבק רפואי וטרינרי (Vetbond, 3M, סנט פול, מינסוטה)
מקורות
- Hua, Y., Schallert, T., Keep, R. F., Wu, J., Hoff, J. T., Xi, G. Behavioral Tests After Intracerebral Hemorrhage in the Rat. Stroke. 33, 2478-2484 (2002).
- James, M., Warner, D., Laskowitz, D. Preclinical Models of Intracerebral Hemorrhage: A Translational Perspective. Neurocritical Care. 9, 139-152 (2008).
- Foerch, C., Arai, K., Jin, G., Park, K. -P., Pallast, S., van Leyen, K., Lo, E. H. Experimental Model of Warfarin-Associated Intracerebral Hemorrhage. Stroke. 39, 3397-3404 (2008).
- Nakamura, T., Xi, G., Hua, Y., Schallert, T., Hoff, J. T., Keep, R. F. Intracerebral hemorrhage in mice: model characterization and application for genetically modified mice. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 24, 487-494 (2004).
- Rynkowski, M. A., Kim, G. H., Komotar, R. J., Otten, M. L., Ducruet, A. F., Zacharia, B. E., Kellner, C. P., Hahn, D. K., Merkow, M. B., Garrett, M. C. A mouse model of intracerebral hemorrhage using autologous blood infusion. Nat. Protocols. 3, 122-128 (2008).
- Wang, J., Fields, J., Doré, S. The development of an improved preclinical mouse model of intracerebral hemorrhage using double infusion of autologous whole blood. Brain Research. 1222, 214-221 (2008).
- Zhao, X., Sun, G., Zhang, J., Strong, R., Song, W., Gonzales, N., Grotta, J. C., Aronowski, J. Hematoma resolution as a target for intracerebral hemorrhage treatment: Role for peroxisome proliferator-activated receptor γ in microglia/macrophages. Annals of Neurology. 61, 352-362 (2007).
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
