הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

Whole-mount עבור ניתוח immunohistochemical vasculature לימב עובריים עור: מערכת מודל לחקר המורפוגנזה מסעף דם בעובר

17.3K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/2620

⸱

20 במאי 2011

 , 
1Laboratory of Stem Cell and Neuro-Vascular Biology, Genetics and Developmental Biology Center, National Heart, Lung, and Blood Institute, National Institutes of Health

במאמר זה

סיכום

אנחנו מציגים אימונוהיסטוכימיה כל הר לייזר מיקרוסקופיית confocal עם תיוג מרובים לניתוח רשת סבוכה היווצרות כלי דם בעור איבר עכבר עובריים.

תקציר

Whole-Mount ניתוח immunohistochemical הדמיה vasculature כולו מרכזי להבנת מנגנוני הסלולר של הסתעפות המורפוגנזה. פיתחנו את העור איבר vasculature מודל ללמוד פיתוח כלי הדם שבו קיימים מקלעת נימי פרימיטיבי הוא ארגן מחדש לתוך רשת מסועפת של כלי הדם הירארכי. Whole-Mount מיקרוסקופיה confocal עם תיוג מרובים מאפשר הדמיה החזקה של כלי הדם ללא פגע, כמו גם מרכיבים תאיים שלהם כולל תאים, pericytes אנדותל ותאי שריר חלק, באמצעות סמנים ניאון ספציפיים. ההתקדמות מודל זה עור vasculature איבר עם מחקרים גנטיים השתפרו הבנה של המנגנונים המולקולריים דפוסים התפתחות כלי הדם. העור האיבר מודל vasculature נעשה שימוש כדי ללמוד איך העצבים ההיקפיים לספק תבנית מרחבית על בידול ועל דפוסים של העורקים. מאמר זה מתאר וידאו פרוטוקול פשוט חזקים כדי כתם הדם שלם עם נוגדנים ספציפיים כלי הדם נוגדנים משני פלורסנט, אשר ישים עבור איברים עובריים vascularized שבו אנו מסוגלים לבצע את תהליך ההתפתחות של כלי הדם.

פרוטוקול

1. איסוף לימב עובריים בעכבר העור (E13.5 ~ E17.5)

  1. להרדים פקוק נוהל שאושר על ידי נשים. על פי פרוטוקול שאושר שלנו חיה, הנקבות מומתים על ידי חשיפה CO 2 והבטיחה מכן על ידי נקע בצוואר הרחם. הנח את חיה על מגבת נייר סופג שלה ולספוג אותו ביסודיות 70% EtOH / H 2 O מבקבוק לחיץ.
  2. לנתח הרחם שלם ולמקם אותו תבשיל 100 x 15 מ"מ פטרי המכילה תמיסת מלח מאוזן קר כקרח "הנקס (HBSS) כדי לשטוף את הדם.
  3. הפרד לנתח את העובר. הסר את amnion דק מאוד מן העובר.
  4. (אופציה) לנתח עובר יחיד 35 x 10 צלחת פטרי מ"מ אם העובר כל צריך להיות genotyped. זנב גזור מועברת צינורית PCR 0.2 מ"ל עבור genotyping.
  5. לנתק את forelimbs של העובר והעברת forelimbs ידי מלקחיים הטבעת לתוך צלחת 24 היטב המכיל 2 מ"ל של Paraformaldehyde קר כקרח 4% טרי (PFA) ב פוספט הצפת מלוחים (PBS).
  6. תקן את forelimbs עם ערבוב עדין על מיקסר Nutator ב 4 ° C למשך הלילה.
  7. למחרת, להסיר את PFA לשטוף שלוש פעמים בתוך 5 דקות של 2 מ"ל PBS עם ערבוב עדין על מיקסר Nutator בטמפרטורת החדר.
  8. מעבירים את forelimbs ב 100% מתנול (MeOH) ולאחסן אותן במקפיא -20 ° C אנזים (במקפיא עם בקרת טמפרטורה קריטית וללא פונקציה להפשיר אוטומטית). נוגדנים ראשיים הרשומים לעבוד טבלה מס '1 לאחר הטיפול MeOH 100%.
  9. מקלפים את העור מן forelimb באמצעות פינצטה בסדר. העור האיבר, כאשר מיובש, צריך להפריד בקלות בין הגפה. ראשית המקום איבר עם הצד הגחוני (צד כף) פונה כלפי מעלה. ואז בעזרת פינצטה בסדר, לחתוך את העור כפי שמוצג בסרטון. הבא לנתח סביב האיבר כולו, לקלף את העור בעדינות, ללא כל נזק.

2. Whole-Mount מכתים immunohistochemical של Skins לימב

  1. רעננותם העור איבר בצינור 5 מ"ל פוליפרופילן מסביב לתחתית ידי דוגרים דרך הסדרה מדורגת של MeOH / PBT דקות (PBS 0.2% + טריטון X-100) 5 (75%, 50%, 25%) עבור כל אחד. שים לב להחלפת פתרונות צריכים להיות זהירים כדי למנוע נזק עורות איבר.
  2. לשטוף פעמיים בתוך 5 דקות PBT עם ערבוב עדין על מיקסר Nutator בטמפרטורת החדר.
  3. חסום את איבר עם עורות עיזים או 10% נסיוב / PBS 0.2% TX100 חיץ חסימת עבור נוגדנים עז משני או 10% חמור בדם / PBS 0.2% TX100 חיץ חסימת עבור נוגדנים חמור משני 2 שעות עם ערבוב עדין על מיקסר Nutator בבית טמפרטורת החדר.
  4. מניחים את הקליפות על איבר 35 x 10 מ"מ צלחת פטרי והעברת ידי מלקחיים הטבעת לתוך צינור microcentrifuge 2ml, עם 800μl של נוגדנים הראשי (דילול בהתאם המפורטים בטבלאות) במאגר חסימת (או 10% עיזים סרום / PBS 0.2 TX100% או 10% חמור בדם / PBS 0.2% TX100). דגירה עורות איבר עם ערבוב עדין על מיקסר Nutator ב 4 ° C למשך הלילה. שים לב כי נוגדנים העיקרי מרובים שמקורם מינים שונים (למשל, נוגדן חד שבטי עכברוש + נוגדן ארנבת polyclonal) יכול לשמש בעת ובעונה אחת.
  5. למחרת, במקום עורות איבר על 35 x 10 מ"מ צלחת פטרי והעברת ידי מלקחיים לתוך טבעת פוליפרופילן 5 מ"ל מסביב לתחתית צינור עם 4ml של למאגר כביסה (או 2% סרום / PBS עיזים 0.2% TX100 או 2 % דונקי סרום / PBS 0.2% TX100).
  6. לשטוף חמש פעמים במשך 15 דקות עם ערבוב עדין על מיקסר Nutator בטמפרטורת החדר.
  7. מניחים את הקליפות על איבר 35 x 10 מ"מ צלחת פטרי והעברת ידי מלקחיים הטבעת לתוך צינור microcentrifuge 2ml, עם 800μl של נוגדנים משני למאגר החסימה (או 10% נסיוב / PBS עיזים 0.2% או 10% TX100 חמור בדם / PBS 0.2% TX100). בדרך כלל אנו משתמשים נוגדנים משני מג'קסון ImmunoResearch (Cy3, Cy5, 1:300 דילולים) או Invitrogen (אלקסה פלואוריד 488, 568 פלואוריד Alexa, Alexa פלואוריד 633, 1:250 דילול). סנן הפתרון נוגדנים משני באמצעות מזרק 0.22μm PVDF מסננים קרום להסיר חלקיקים מצטברים של נוגדנים משני. דגירה עורות איבר בחושך או עטוף בנייר אלומיניום למשך שעה 1 עם ערבוב עדין על מיקסר Nutator בטמפרטורת החדר. שים לב שונות נוגדנים ניאון משני מצומדות נגזר מינים שונים יכול לשמש בעת ובעונה אחת.
  8. מניחים את הקליפות על איבר 35 x 10 מ"מ צלחת פטרי והעברת ידי מלקחיים הטבעת לתוך צינור פוליפרופילן 5 מ"ל עגול עם תחתית 4ml של למאגר כביסה (או 2% סרום / PBS עיזים 0.2% או 2% TX100 חמור בדם / PBS 0.2% TX100). לשטוף חמש פעמים במשך 15 דקות בחושך או עטופים ברדיד אלומיניום עם ערבוב עדין על מיקסר Nutator בטמפרטורת החדר.
  9. (אפשרות counterstaining נגד גרעין) דגירה עורות איבר עם 4ml של למאגר כביסה (או עיזים 2% סרום / PBS 0.2% או 2% TX100 סרום / PBS דונקי 0.2% TX100) עם To-Pro-3 (Invitrogen T3605 , 1:3000 דילול) בחושך או עטוף בנייר אלומיניום עבור 10 דקות עם ערבוב עדין על מיקסר Nutator בחדר temperatuמחדש. לאחר מכן, לשטוף שלוש פעמים במשך 5 דקות עם 4ml של למאגר כביסה (או 2% סרום / PBS עיזים 0.2% או 2% TX100 חמור בדם / PBS 0.2% TX100) בחושך או עטוף בנייר אלומיניום עם ערבוב עדין על מיקסר Nutator בטמפרטורת החדר. שים לב, מכתים חזקה ספציפית עבור גרעינים הוא ציין עבור To-Pro-3 הפליטה ספציפי (עירור HeNe 633 ננומטר).

3. הרכבה Skins לימב על הסט

  1. מניחים את הקליפות על איבר 35 x צלחת פטרי 10 מ"מ. הסר dusts, קריסטלים, סיבים בשכבה הפנימית של העור בעזרת פינצטה קנס כאמור stereomicroscope עם תאורה נמוכה, כדי למנוע צילום נרחב הלבנה.
  2. מעבירים את הקליפות איבר להחליק מיקרוסקופיים דבק ידי מלקחיים טבעת. מניחים את הקליפות בשכבה הפנימית שוכב מעלה בשקופית (כלומר כלפי coverslip). שטחו את הקליפות בזהירות באמצעות פינצטה בסדר להסיר לשאת על כביסה חיץ ידי Kimwipe.
  3. הר אנטי לדעוך התקשורת הרכבה ללא בועות אוויר. אנו משתמשים coverslip 25 "x25". Cure על משטח שטוח בחושך (למשל, באמצעות דגימות רכוב להאריך מגיב זהב ממוקמים לילה בטמפרטורת החדר בחושך לפני הצפייה). עבור אחסון לטווח ארוך, לאטום את coverslip לשקופית ולאחסן ב 4 ° C.

4. Confocal מיקרוסקופית

  1. הגדרת לייזרים מתאים fluorophores. אנו משתמשים Leica SP5 TCS מיקרוסקופ confocal עם שלושה מקורות לייזר כולל ארגון 488nm (עבור Alexa פלואוריד 488 ו-GFP), DPSS 561nm (עבור Alexa פלואוריד 568 ו Cy3) ו HeNe 633nm (עבור Alexa פלואוריד 633, Cy5 ו To-Pro-3) .
  2. השתמש בכלי סריקה רציפים כדי למנוע או להפחית את crosstalk שבו כל צבעי בדגימות להכפיל או לשלש מוכתם יהיה נרגש באותו זמן. במצב סריקה סדרתית, תמונות תירשם צו רציפים.
  3. מידע כללי נוסף על צבעי ניאון ולייזרים עבור עירור ניתן נוסדה בשנת "מיקרוסקופיה confocal עבור ביולוגים" של היבס (2004)

5. נציג תוצאות

Whole-Mount מיקרוסקופיה immnofluorescence תווית משולשת confocal בעור forelimb העכבר E15.5 עם נוגדנים סמן הפאן אנדותל התא PECAM-1 (איור 1A-C, D כחול), סמן neurofilament 2H3 (איור 1A ירוק), תא השריר החלק סמן αSMA (איור 1 א ', ב' אדום) עולה דפוס אופייני הסתעפות של העורקים αSMA +, מיושר עם 2H3 + עצבים היקפיים בעור איבר. בנוסף כלי הדם הסתעפות העור זה איבר מודל vasculature משמש ללמוד דפוסים של כלי הלימפה הסתעפות באמצעות נוגדנים את הסמן אנדותל הלימפה תא LYVE-1 (איור 1D, E אדום) Neuropilin2 (NRP2) (1D איור, F ירוק ).

איור 1
באיור 1. (AC) העורקים להתיישר עם העצבים ההיקפיים בעור איבר עוברי. Whole-Mount תווית משולשת מיקרוסקופיה immnofluorescence confocal עם נוגדנים סמן הפאן אנדותל התא PECAM-1 (AC, כחול), סמן neurofilament 2H3 (A, ירוק), תא השריר החלק סמן αSMA (A ו-B, אדום ) מוצג. בשלב E15.5, 2H3 + העצבים ההיקפיים (חיצים פתוח) לקשר עם העורקים (ראשי חץ) אשר מכוסים על ידי αSMA + לתאי שריר חלק. (DF) הלימפה בכלי הדם בעור איבר עוברי. התווית Triple-מיקרוסקופיה immnofluorescence confocal עם נוגדנים סמן הפאן אנדותל התא PECAM-1 (D, כחול), סמן תא האנדותל הלימפה LYVE-1 (D ו-E, אדום) Neuropilin2 (NRP2) (D ו-F, ירוק ) מוצג. כלי הלימפה הם דמיינו ידי שני LYVE-1 ו NRP2, ואילו LYVE-1 מתבטא גם על ידי משנה של מקרופאגים (ראשי חץ פתוח). בר סולם: 100μm.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

מערכת כלי הדם חיונית להתפתחות איבר במהלך embryogenesis כמו גם עבור פונקציות תחזוקה איבר הרבייה אצל מבוגרים, כי הוא מספק מספיק חמצן וחומרים מזינים את האיברים. רשת כלי דם תקין היא מבוססת היטב עם תהליכים מורכבים ורב צעד אנגיוגנזה שבו קיימים רשת נימי הוא מחדש עם מבנים מסועפת מאוד היררכי. למרות עבודות רבות הראו כי מגוון של מולקולות מעורב בתהליכים הללו, זה לא היה ברור עד כמה איברים או רכיבים שלהם לספק את האותות כדי לקדם את התהליך בשלבים של התפתחות כלי הדם, כולל בידול דפוסים האנדותל של כ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

אין ניגודי אינטרסים הכריז.

תודות

אנו מודים ק גיל לסיוע עם גידול העכבר טיפול לניהול מעבדה. תודה גם לחברי Mukoyama מעבדה לעזרה טכנית. המימון ניתן על ידי תוכנית המחקר עירונית של מכוני Naitonal הבריאות.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

נוגדנים

פאן תא האנדותל סמן

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
נוגדן מין חברה קטלוג # תנאי עבודה
PECAM-1 אוגר ארמני (M) Chemicon MAB1398Z 1:100 דילול # 1
PECAM-1 עכברוש (ז) BD 553369 דילול 1:300
VEGFR2 עכברוש (ז) eBioscience 14-5821-82 דילול 1:200
CD34 עכברוש (ז) eBioscience 13-0341 דילול 1:300
קולגן IV הארנב (P) עבד Serotec 2150-1470 1:300 דילול # 2

העורקים תא האנדותל סמן

נוגדן מין חברה קטלוג # תנאי עבודה
Neuropilin1 הארנב (P) Kolodkin אלכס מעבדה # 3 1:3000 דילול
Unc5H2 עיזים (P) R & D AF1006 דילול 1:200

ורידי סמן תא האנדותל

נוגדן מין חברה קטלוג # תנאי עבודה
EphB4 עיזים (P) R & D AF446 דילול 1:100

תא האנדותל הלימפה סמן

נוגדן מין חברה קטלוג # תנאי עבודה
LYVE-1 # 4 הארנב (P) Abcam ab14917 דילול 1:200
LYVE-1 # 4 עכברוש (ז) MBL D225-3 דילול 1:200
Prox-1 הארנב (P) Chemicon AB5475 1:1000 דילול
Prox-1 עיזים (P) R & D AF2727 1:50 דילול
Neuropilin2 הארנב (P) תא האיתות 3366 1; 100 דילול
Podoplanin אוגר סורי (M) Hybridoma בנק 8.1.1 דילול 1:200

שריר חלק תא / pericyte סמן

נוגדן מין חברה קטלוג # תנאי עבודה
αSMA-Cy3 עכבר (M) # 5 סיגמא c-6198 1:500 דילול # 6
NG2 הארנב (P) Chemicon AB5320 דילול 1:200
SM22α הארנב (P) Abcam ab14106 דילול 1:200

נוגדנים עבור עיתונאי ה-GFP

נוגדן מין חברה קטלוג # תנאי עבודה
GFP הארנב (P) Invitrogen A11122 דילול 1:300
GFP עכברוש (ז) Nacalai tesque 04404-84 1:1000 דילול
GFP צ'יק (P) Chemicon P42212 דילול 1:300

נוגדנים עבור כתב LacZ

נוגדן מין חברה קטלוג # תנאי עבודה
β-gal הארנב (P) MP ביו 55976 1:5000 דילול
β-gal עיזים (P) עבד Serotec 4600-1409 דילול 1:500
β-gal צ'יק (P) Abcam ab9361 דילול 1:200

נוגדנים עבור האקסון הפריפריה

נוגדן מין חברה קטלוג # תנאי עבודה
2H3 עכבר (M) # 7 Hybridoma בנק 2H3 דילול 1:200
Tuj1 עכבר (M) # 8 Covance MMS-435P דילול 1:500
Peripherin הארנב (P) Chemicon AB1530 1:1000 דילול

נוגדנים להעברת בתאי שוואן

BFABP הארנב (P) תומאס מולר המעבדה # 9 1:3000 דילול

(P): נוגדן polyclonal, (M): נוגדנים חד שבטיים

# 1: אנטי ארמני עיזים אוגר-Cy3 (ImmunoResearch ג'קסון 127-165-160) נוגדן צריך לשמש נוגדן משנית.

# 2: הנוגדן IV קולגן יכול לשמש כדי לזהות כלי דם לאחר הכלאה ב באתרה.

# 3: הנוגדן Neuropilin1 מסופק על ידי חביב במעבדה Kolodkin של אלכס באוניברסיטת ג'ונס הופקינס. כבשה נגד נוגדן אנושי Neuropilin1 זמין במו"פ (AF3870), למרות שאנו לא צריך לבדוק את זה עדיין.

# 4: LYVE-1 נוגדנים גם לזהות תת קבוצה של מקרופאגים בעור עובריים.

# 5: נוגדנים נגד αSMA הוא עכבר נוגדנים חד שבטיים IgG2a.

# 6: נוגדן Cy3-מצומדות αSMA הוא מודגרות שעה 1 בטמפרטורת החדר יחד עם שניותנוגדנים ondary עבור נוגדנים ראשוניים אחרים.

# 7: 2H3 נוגדן הוא עכבר נוגדנים חד שבטיים נגד IgG1 neurofilament.

# 8: Tuj1 נוגדן הוא עכבר נוגדנים חד שבטיים נגד IgG2a Neuron ספציפיים בכיתה ג'בטא טובולין.

# 9: נוגדן (מוח ספציפיים חומצת שומן חלבון מחייב) BFABP מסופק בחביבות על ידי המעבדה של תומאס מולר ב-Max-Delbrück המרכז לרפואה מולקולרית.

מקורות

  1. Mukouyama, Y. S., Shin, D., Britsch, S., Taniguchi, M., Anderson, D. J. Sensory nerves determine the pattern of arterial differentiation and blood vessel branching in the skin. Cell. 109, 693-705 (2002).
  2. Mukouyama, Y. S., Gerber, H. P., Ferrara, N., Gu, C., Anderson, D. J. Peripheral nerve-derived VEGF promotes arterial differentiation via neuropilin 1-mediated positive feedback. Development. 132, 941-952 (2005).
  3. Wang, H. U., Chen, Z. F., Anderson, D. J. Molecular distinction and angiogenic interaction between embryonic arteries and veins revealed by ephrin-B2 and its receptor Eph-B4. Cell. 93, 741-753 (1998).
  4. Gerety, S. S., Wang, H. U., Chen, Z. F., Anderson, D. J. Symmetrical mutant phenotypes of the receptor EphB4 and its specific transmembrane ligand ephrin-B2 in cardiovascular development. Mol Cell. 4, 403-414 (1999).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

Whole-mount עבור ניתוח immunohistochemical vasculature לימב עובריים עור: מערכת מודל לחקר המורפוגנזה מסעף דם בעובר
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.