Method Article

Passaging אדם בתאי גזע עצביים

DOI:

10.3791/263

⸱

August 22nd, 2007

 , 
1Department of Pathology, University of California, Irvine (UCI)

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

היכולת לתפעל האדם גזע עצביים / מבשר תאים (hNSPCs) במבחנה מאפשרת לחקור את השירות שלהם, כמו השתלות תאים למטרות טיפוליות לחקור ההתפתחות העצבית האנושית. פרוטוקול זה מציג שיטה culturing ו hNSPCs passaging בתקווה reproducibility גדל והולך של מחקרים תא גזע אנושיים.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

היכולת לתפעל האדם גזע עצביים / מבשר תאים (hNSPCs) במבחנה מספק אמצעי לחקור את השירות שלהם, כמו השתלות תאים למטרות טיפוליות, כמו גם לחקור תהליכים בסיסיים רבים של ההתפתחות העצבית הפתולוגיה האנושית. פרוטוקול זה מציג שיטה פשוטה של ​​culturing ו hNSPCs passaging בתקווה סטנדרטיזציה בטכניקה זו והגדלת reproducibility המחקר תא גזע אנושיים. HNSPCs אנו משתמשים נותקו מן cadaveric בקורטקס המוח לאחר הלידה על ידי משאב לאומי אנוש עצבית לתאי גזע גדל כמו תרבויות חסיד על צלוחיות מצופה פיברונקטין (פאלמר et al, 2001;.. שוורץ et al, 2003). אנחנו תרבות hNSPCs שלנו DMEM: F12 סרום ללא מדיה בתוספת EGF, FGF ו PDGF ומעבר להם 01:02 בערך כל שבעה ימים. שימוש בתנאים אלה, רוב התאים בתרבות לשמור על מורפולוגיה דו קוטבית להביע סמנים של מובחן בתאי גזע עצביים (כגון nestin ו Sox2).

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הערה: לקבלת culturing שגרתית של hNSPCs שלנו, אנו משנים 50-100% של התקשורת בכל יום אחר, ובדרך כלל מעבר להם 01:02 פעם בשבוע. תרבות התקשורת מכיל סיביות 9500 20%, 1X גורמים אנטיביוטי / antimycotic, וצמיחה (EGF, FGF, ואת כל PDGF ב 40 ng / ml) ב DMEM: F12 התקשורת הבסיס.

הכנת Flask מצופה dissociating תאים

  1. כדי להכין צלוחיות חדש עבור התאים passaged, מעיל T25 צלוחיות עם 10 מיקרוגרם / מ"ל ​​פיברונקטין האדם EMEM במשך 4 שעות או לילה, בתוך 37 ° C רקמות התרבות בחממה. ממש לפני passaging התאים, להסיר את הפתרון פיברונקטין ולשטוף את צלוחיות עם PBS.
  2. מעבירים את הישן "מותנית" התקשורת מתאי להיות passaged את פיברונקטין מצופה צלוחיות חדשים (כגון כי במחצית נפח הסופי של המדיה עבור כל בקבוק יהיה "מותנה" התקשורת). אלה התנאים culturing לסייע לשמור על התאים האלה במצב מובחן שלהם.
  3. לאחר שכל התקשורת היא להסיר את התאים להיות passaged, יש לשטוף את התאים פעם עם PBS. שימו לב שלא לייבש את התאים.
  4. הוספת תא דיסוציאציה הצפת (CDB) ישירות על גבי התאים (1.0-1.5 מ"ל עבור בקבוק T25). דגירה תאים למאגר כ -5 דקות בטמפרטורת החדר. בעדינות את הבקבוק הקשה תסייע להאיץ את ניתוק התא.

Centrifuging, Resuspending, ותאי ציפוי

  1. הוסף סרום המכיל מדיה (DMEM: F12 עם 10% חום מומת בסרום שור עוברי) (להשתמש ~ נפח 3X של CDB) כדי הבקבוק עם תאים מנותקת. הסר את המדיה התאים צינור חרוטי 15 מ"ל. השתמש נפח קטן של סרום המכיל התקשורת טרי לשטוף את הבקבוק ולשחזר תאים שיורית.
  2. צנטריפוגה התקשורת תאים ב 1000 סל"ד (~ 200xg) במשך 5 דקות.
  3. יניקה מעל סרום המכיל מדיה resuspend התאים בתקשורת תרבות טריים, pipetting מעלה ומטה כדי ליצור השעיה תא הומוגנית.
  4. העברת מחצית התאים resuspended לתוך בקבוק אחד חדש לפצל 01:02. שים לב למספר קטע חדש על הבקבוק.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מצאנו כי פרוטוקול זה מספק אמין של תרבויות hNSPCs. גורם אחד קריטי עבור התאים שלנו היא שהם צריכים להיות כל הזמן כמו תרבויות צפוף למדי, ולא ניתן passaged עד כדי כך התאים דלילה. בידיים שלנו, תרבויות דליל לצמוח באיטיות רבה או לחלוטין הפסקת חלוקת. מסיבה זו, אנו בדרך כלל לפצל התרבויות שלנו 01:02 או 01:03, כאשר התרבות היא צפופה מאוד. את פני השטח של ציפוי צלחת תרבות עם פיברונקטין חשוב שכן הוא מקדם מצורף תא הגירה טוב, אבל, בניגוד laminin, הוא גם מאפשר את השימוש Cell דיסוציאציה חוצץ (CDB) לנתק את התאים. מצורף Ce...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים מודים בתודה ד"ר פיליפ שוורץ ח של המשאבים הלאומיים האדם עצבית לתאי גזע בבית החולים לילדים, אורנג' קאונטי מכון המחקר למתן hNSPCs והדרכה ראשונית culturing שלהם.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
BIT-9500 (BSA, אינסולין, טרנספרין)ReagentStem Cell Technologies09500
מגיבאנטיביוטי-אנטי-מיקוטיInvitrogen15240-062
DMEM:F12 (1X)ReagentInvitrogen11330-032
EMEM (1X)ReagentMediatech, Inc.MT-10-010-CVמופץ על ידי פישר תחת הקטלוג המצוין #
Fetal BovineSerum ReagentInvitrogen10437-028
ריאגנטרקומביננטי בסיסי אנושיPeproTech Inc100-18B
PDGF-ABReagentPeproTech Inc100-00AB
EGF, מגיב רקומביננטי אנושיBD BiosciencesCB40052מופץ על ידי פישר תחת הקטלוג המצוין #
בקבוק תרבית תאים, 25 סמ"רכלי קורנינג10-126-28מופץ על ידי פישר תחת הקטלוג המצוין #
Fibronectin, human,natural ReagentBD BiosciencesCB40008Aמופץ על ידי פישר תחת הקטלוג המצוין #
Human Neural Stem Cells/PrecursorCellsNational Human Neural Stem Cells
מגיבמאגר דיסוציאציה של תאיםInvitrogen13150-016
FGF,

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Flanagan, L. A., Rebaza, L. M., Derzic, S., Schwartz, P. H., Monuki, E. S. Regulation of human neural precursor cells by laminin and integrins. J. Neurosci. Res. 83, 845-856 (2006).
  2. Nethercott, H. N., Maxwell, H., Schwartz, P. H. Neural stem cell culture. Human Stem Cell Manual: A Laboratory Guide. Loring, J. F., Wesselschmidt, R. W., Schwartz, P. H. , Elsevier/Cell Press. (2007).
  3. Palmer, T. D., Schwartz, P. H., Taupin, P., Kaspar, B., Stein, S. A., Gage, F. H. Cell culture. Progenitor cells from human brain after death. Nature. 411, 42-43 (2001).
  4. Schwartz, P. H., Bryant, P. J., Fuja, T. J., Su, H., O'Dowd, D. K., Klassen, H. Isolation and characterization of neural progenitor cells from post-mortem human cortex. J Neurosci Res. 74, 838-851 (2003).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Human Neural Stem CellsCell PassagingFibronectin CoatingCell Dissociation BufferSerum Free MediaT25 Flask CultureCentrifugation ResuspensionImmunofluorescence StainingTransfection ProtocolCell Counting

Related Articles