הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

השלמה Fluorescence bimolecular

27.8K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/2643

⸱

15 באפריל 2011

 , 
1Department of Pharmacology, University of Illinois at Chicago

במאמר זה

סיכום

Subcellular לוקליזציה של חלבונים חשוב בקביעת הרגולציה במרחב ובזמן של איתות התא. כאן אנו מתארים השלמה הקרינה bimolecular (BiFC) כשיטה פשוטה לניטור אינטראקציות המרחבי של חלבונים בתא.

תקציר

הגדרת הפצה subcellular של קומפלקסים איתות הכרחי להבנת פלט מורכב. בשיטות המקובלות כגון immunoprecipitation אינם מספקים מידע על לוקליזציה המרחבי של קומפלקסים. לעומת זאת, BiFC מנטר את האינטראקציה מידור subcellular של קומפלקסים חלבונים. בשיטה זו, חלבון fluororescent מחולק ללא פלורסנט שברי אמינו ו-carboxy מסוף אשר התמזגו אז שני החלבונים של עניין. אינטראקציה של תוצאות חלבונים הכינון מחדש של fluorophore (איור 1) 1,2. הגבלה של BiFC היא שברגע fluorophore מקוטעת הוא מחדש המתחם הוא בלתי הפיך 3. מגבלה זו יש יתרון באיתור אינטראקציות חולף או חלש, אבל מונע ניתוח הקינטית של דינמיקה מורכבת. אזהרה נוספת היא כי flourophore מחדש דורש 30 דקות להבשיל לזרוח, שוב מניעת התצפית של אינטראקציות בזמן אמיתי 4. BiFC היא דוגמה ספציפית של assay שבר השלמה חלבון (PCA) המעסיקה חלבונים הכתב כגון ירוק גרסאות חלבון פלואורסצנטי (BiFC), dihydrofolate רדוקטאז, ב-lactamase, ו בלוציפראז למדוד חלבון: אינטראקציות חלבון 5,6. שיטות חלופיות ללמוד חלבון: אינטראקציות חלבון בתאים כוללים העברת הקרינה שיתוף לוקליזציה פורסטר תהודה אנרגיה (סריג) 7. עבור לוקליזציה משותפת, שני חלבונים מתויגים בנפרד במישרין עם fluorophore או עקיף על ידי immunofluorescence. עם זאת, גישה זו מובילה רקע גבוהה של אי - אינטראקציה חלבונים ולכן קשה לפרש שיתוף לוקליזציה נתונים. בנוסף, בשל מגבלות רזולוציה של מיקרוסקופיה confocal, שני חלבונים עשוי להופיע ללא שותף מקומי בהכרח אינטראקציה. עם BiFC, הקרינה היא נצפתה רק כאשר שני החלבונים עניין אינטראקציה. סריג הוא עוד שיטה מצוינת ללימוד חלבון: אינטראקציות חלבון, אבל יכול להיות מאתגר מבחינה טכנית. סריג ניסויים דורשים את התורם acceptor להיות של בהירות stoichiometry דומים בתא. בנוסף, יש להסביר לדמם דרך של התורם לתוך התעלה acceptor ולהיפך. בניגוד סריג, BiFC יש קצת רקע הקרינה, קצת פוסט עיבוד של נתוני התמונה, אינו מחייב overexpression גבוה, והוא יכול לזהות אינטראקציות חלשות או חולף. תהודה פליטת אור העברת אנרגיה (ברט) היא שיטה דומה סריג פרט התורם הוא אנזים (בלוציפראז למשל) המזרז מצע להפוך bioluminescent מרגש ובכך acceptor. ברט חסרה את הבעיות הטכניות של לדמם דרך הקרינה רקע גבוהה אך חסר את היכולת לספק מידע מרחבי בשל היעדר מצע של לוקליזציה ל 8 תאים ספציפיים. בסך הכל, BiFC היא שיטה מצוינת חזותי לוקליזציה subcellular של קומפלקסים חלבונים כדי לקבל תובנה איתות מידור.

פרוטוקול

א BiFC כיול

  1. בחר fluorophore. ישנם fluorophores מרובים, כגון YFP ונוגה, שפועלים גם שותפים BiFC היתוך (טבלה 1). מסתיים אמינו ו-carboxy הטרמינל של ונוס מסוגלים ליצור מורכבות על 37 מעלות צלזיוס, בעוד שברי BiFC YFP דורשים הדגירה טרום ב 30 ° C כדי להקל על היווצרות fluorophore 2. זה הדגירה בטמפרטורה נמוכה עשויה לשנות כמה תהליכים תאיים וצריך להילקח בחשבון בעת ​​בחירת שברים. וקטורים עבור פיוזינג ונוס הסופית carboxy-של חלבונים זמינים Addgene ( http://www.addgene.org/pgvec1 ; seepBiFC-VN173 ו-VC155 pBiFC) יחד עם מבנים נוספים לשימוש שולטת, למשל, pBiFC-bJunVN173 ו pBiFC-bFosVC155 2. וקטורים נוסף, לרבות אמינו מסוף וקטורים ונוס (pFLAG VN173 ו-PHA-VC155), זמינים בכתובת האתר הבא: http://people.pnhs.purdue.edu/ hu1 ~ / .
  2. תג החלבון של עניין. שברי BiFC הם התמזגו מסתיים אמינו או carboxy-הטרמינל של חלבונים מועמד. חלבונים מסוימים עשויים שלא לאפשר תיוג בסוף או בשל הפרעה של תפקוד החלבון. לדוגמה, רבים מבני superfamily ראס של GTPases הם השומנים שונה בכל התקשרות carboxy-הסופית ובכך מניעת של שברי BiFC בסוף זה. לפיכך, חשוב לקבל קצת מושג איך הקובץ המצורף של שברי BiFC עשוי להשפיע על התפקוד של חלבונים של עניין. אם לא ברור כיצד תיוג חלבון ישפיע שילובים פונקציה מרובים שלה צריך להיבדק. בנוסף בקטע BiFC, והמקשר פפטיד עשוי להיכלל להגדיל את הגמישות בין fluorophore מקוטעת החלבונים מועמד. בעוד אתרי שיבוט מרובים (MCS) ב וקטורים BiFC לקודד קצר מותח חומצת אמינו אשר עשויים לספק גמישות מספקת, RSIAT, KQKVMNH ו linkers RPACKIPNDLKQKVMNH שימשו בהצלחה בניסויים BiFC 3,9
  3. לקבוע תנאים transfection. בדיקות לפני מוטציות רבות, ניסויים לשלוט כמה צריך להתבצע. שני הראשונים שילובים BiFC כי יש לנסות הם שני חלבונים סוג בר שידוע כי הם אינטראקציה מסוג אחד פרוע מוטנטים שאינם אינטראקציה. באמצעות שני אלה שילובים, כמויות שונות של דנ"א פעמים transfection צריך להיבדק כדי לקבוע התנאים האופטימליים לאיתור אות BiFC עבור חלבונים מועמד. מומלץ לבדוק 0.25ug, 0.5ug, 1.0ug של לבנות כל BiFC עבור יחיד גם מנה 6 באר. למחרת לפקח תאים transfection על ידי מיקרוסקופ פלואורסצנטי כדי לקבוע זמן אופטימלי לפיתוח האות. PBiFC-bJunVN173 ו-pBiFC bFosVC155 2 בונה הם שולטת חיובית שימושי BiFC ו זמינים Addgene (ראה לעיל). בנוסף, ניתוח המערבי כתם יש לבצע על מנת לאשר ביטוי שווה של בונה. התנאים צריכים להיבחר כך אות ניאון הוא ציין בין שני חלבונים סוג בר, אבל לא מעט כדי לאותת הוא ציין בין סוג בר חלבונים מוטנטיים. לבסוף, היא הטובה ביותר לשמור על ביטוי החלבון נמוך ככל האפשר כדי למנוע כל אי - אינטראקציות ספציפיות.
  4. קבע אם תוספת של שברי BiFC משנה את לוקליזציה של חלבונים של עניין. כל לבנות BiFC מכיל גם HA או epitope תג הדגל. Immunostain transefected תאים HA הן או epitope תג הדגל וכן גם את החלבון אנדוגני (במידת האפשר) כדי לקבוע אם תג BiFC משפיע לוקליזציה של חלבונים של עניין.

ב ציפוי ו transfection של תאים

  1. תאים COS (1.3x10 5) הם אחד על אחד מצופה צלחת תחתית זכוכית Matek ושתי בארות צלחת 6-באר לדגימה. אפשר תאים להתיישב לילה בשעה 37 ° C. סוגי תאים חלופיים שרלוונטיים יותר את החלבונים מועמד הריבית עשוי לשמש גם.
  2. הכן DNAs עבור transfection. בדרך כלל אנו מנצלים Lipofectamine (Invitrogen) עבור transfections COS. עם זאת, ריאגנטים אחרים עשויים להיות מתאימים יותר עבור הקו הסלולרי של עניין. מאז תערובת transfection יפוצל בין מנה כוס אחת התחתונה שתי בארות של צלחת 6-היטב, השתמש את הכמות המתאימה של ה-DNA כדי להסביר את החלוקה הזאת. מדולל דנ"א 250uL של נסיוב חינם (SF) DMEM. הוסף CFP את כמות 1 / 5 של DNAs BiFC סך כביקורת transfection. עבור כימות BiFC, התאים רק שהם חיוביים CFP ינותחו נוכחות של אות BiFC. שים לב ספקטרה CFP תהיה חפיפה עם כמה זוגות BiFC בטבלה 1, ולכן פקד transfection חלופיצריך אולי. מדולל ב Lipofectamine 250uL SF DMEM (10uL Lipofectamine/1ug של ה-DNA). מערבבים את הדנ"א דילולים Lipofectamine. דגירה בטמפרטורת החדר למשך 20min.
    הערה: Lipofectamine: יחס ה-DNA יכול להשתנות בהתאם לסוג התא. השתמש בשיטה transfection מתאים לקו הנייד של עניין.
  3. יש לשטוף את התאים 2x חם עם SF DMEM. הוסף 2ml של המדע הבדיוני DMEM על כל צלחת זכוכית התחתון או גם של המנה 6 באר.
  4. פיצול כל התערובת באופן שווה בין transfection צלחת כוס אחת התחתונה שתי בארות מנה 6 באר.
  5. דגירה התאים ב 37 מעלות 5hrs.
  6. הסר מדיה transfection ולהחליף עם התקשורת מלאה (DMEM 10% FBS).
  7. דגירה תאים לילה בשעה 37 ° C. משך הדגירה transfection הבאים ישתנו בהתאם ברמות הביטוי של חלבונים של עניין. דגירה ממושכת עלולה לגרום לאינטראקציה לא מוגדרים כך שלב זה יהיה צורך נקבע באופן אמפירי.

ג הכנת תאים עבור הדמיה

  1. תאים הם בדקו בתחילה תחת מיקרוסקופ epifluorescent כדי להבטיח שליטה חיובית ניאון. אם לא, זה עשוי להיות נחוץ כדי לאפשר לתאים זמן נוסף על 37 מעלות צלזיוס עד אות הוא ציין.
  2. יש לשטוף את התאים 3x עם PBS (pH 7.4). כדי התאים בצלחת תחתית זכוכית paraformaldehyde להוסיף 2% (pH 7.4). תקן תאים 10min על הקרח. יש לשטוף את התאים 3x עם PBS (pH 7.4). תאים חנות ב 4 ° C מכוסה 1mL PBS (pH 7.4). תאים לא צריך להיות קבוע עבור הדמיה, אבל ברגע שברי BiFC הרפורמה fluorophore שלם הוא ניתוח ובכך למנוע הפיכה של אינטראקציות דינמי 3. כמו כן, יש לזכור כי תאים מבולבל תמשיך לפתח האות. Lyse התאים בצלחת 6-הבאר להכין lysates לניתוח כתם המערבי. חשוב כי כל התאים מוכנים באותו זמן כל כך התאים lysed מייצגים את התאים הדמיה.

ד דימות תאים

  1. עוצמת הקרינה יחושב לכל תא. הקפד תאים תמונה בנפרד.
  2. CFP נכלל כביקורת tranfection ורק תאים חיובי CFP שנבחרו לניתוח אותות BiFC. אנחנו עושים את ההנחה כי אם התא transfected עם CFP, הוא transfected גם עם בונה BiFC. גישה זו מבטיחה כי התאים אשר צילמו חוסר איתות BiFC הן שליליות בשל חוסר של אינטראקציה בין החלבונים של עניין ולא בשל העדר של אחד או שני מבנים BiFC ביטוי באותו תא.
  3. אנו משתמשים LSM Zeiss 510 מיקרוסקופ confocal הדמיה התא. בעת שימוש במיקרוסקופ חשוב לשמור את הזום, חריר, לזכות גלאי, מגבר אופסט, גודל המסגרת, מהירות סריקה, סריקה ממוצע, וכוח לייזר עקבי. כאשר משתמשים בכל מערכת הדמיה חשוב לשמור הגדרות קבוע כך שההנהרה להשוות בין דגימות. כמו כן, כאשר כימות הקרינה חשוב פיקסלים לא רוויים.

א כימות הקרינה

  1. Fluorescence ניתן לכמת באמצעות כל תוכנת הדמיה. אנו מנצלים ImageJ אשר זמין באופן חופשי מ-NIH (http://rsb.info.nih.gov/ij/). פתיחת קבצי תמונה ImageJ. עבור מדידות AnalyzeSet. סמן את התיבות עבור שטח ו Mean ערך גריי בתיבת המדידות.
  2. באמצעות הכלי 'בחירה יד חופשית ", לצייר מתאר מסביב לקצה של התא כולו בערוץ CFP.
  3. השארת זה המתאר במקום, משמרת לערוץ YFP. עבור AnalyzeMeasure.
    ערך אפור ממוצע הוא סכום של ערכי האפור של כל הפיקסלים בבחירה מחולק במספר של פיקסל (כלומר, את עוצמת הקרינה הממוצעת באזור של התא).
  4. עבור כל תמונה לצייר עיגול בערוץ YFP באזור שאינו מכיל תאים. קחו מדידה עבור אזור זה כרקע. נפחית את הרקע של כל תמונה.
  5. ערך ממוצע האפור ממוצע מינוס על רקע כל התאים צילמו במדגם אחד. זו תהיה עוצמת הקרינה הממוצעת בקרב האוכלוסייה של תאים. היינו ממליצים על 60 תאים במשך שלושה ניסויים לכימות.

פ נציג תוצאות:

המעבדה שלנו מתמקדת חלבון רב בתחום פיגומים, intersectin (ITSN) אשר מקיים אינטראקציה עם חלבונים רבים להסדיר הביוכימיים והאיתות מספר 10,11,12,13,14. ITSN מכיל שני Eps15 הומולוגיה (EH) תחומים, אזור מפותל, מפותל, וחמישה הומולוגיה Src 3 (SH3) תחומים. איזופורם יותר של ITSN מכיל גם הומולוגיה DBL (ד"ה) ו pleckstrin (PH) הומולוגיה תחומים לפעול בתיאום כגורם חילופי גואנין נוקלאוטיד עבור Cdc42 15. זהו מבנה מודולרי מקדמת חלבון: אינטראקציות חלבון וגורם ITSN מועמד אידיאלי עבור ניסויים BiFC. לוקליזציה של subcellular ITSN יכול לשנות את השותפים שלה, ולכן מחייב לשנות את המסלולים מוסדר על ידי ITSN (unpublisהד נתונים). לאחרונה במעבדה שלנו הוכיחה כי ITSN מסדיר הישרדות העצבית באמצעות רגולציה של רומן בכיתה השנייה PI3K, PI3K-C2β 11. אמינו מסוף Pro עשיר של תחום C2β-PI3K מכיל שני אתרי קישור תחומים SH3 של ITSN. באמצעות שיתוף immunoprecipitation עם ITSN PI3K ו-C2β מוטנטים גמימה הראינו כי SH3A ITSN של תחומים SH3C אינטראקציה עם האזור אמינו הטרמינל של C2β-PI3K. בשלב הבא, השתמשנו BiFC לדמיין את לוקליזציה subcellular של מורכבות זו. ITSN היה התמזגו אמינו הסופית של ונוס (pFLAG-VN173) ו-PI3K C2β בונה התמזגו carboxy-הסופית של ונוס (PHA-VC155). כפי בקרה אחר שלילי, פפטיד הלא ספציפית היתה התמזגו PHA-VC155. VN-ITSN ו-VC-PI3K C2β יצרו מורכבות BiFC עם הפצה לפסק (איור 2A, לוחות העליונה). מוטציות תחום Pro עשיר של C2β-PI3K כי לשבש את שיתוף משקעים של ITSN PI3K ו-C2β ירד האות BiFC (איור 2A, לוחות נמוך) 11. זה ההבדל בין אות BiFC ITSN ושני PI3K-C2β חלבונים לא היה בשל ההבדלים ביטוי חלבון (תרשים 2B).

איור 1
. באיור 1 ב BiFC, fluorophore (במקרה זה ונוס) מחולק אמינו (VN) - ו carboxy (VC), מסוף מסתיים. קצוות אלה התמזגו שני החלבונים של עניין. כאשר שני החלבונים אינטראקציה, שברי VN ו VC שייך מחדש וכתוצאה מכך הכינון מחדש של fluorophore ואת הקרינה באתרים של אינטראקציה. BiFC היא דוגמה ספציפית של assay שבר השלמה חלבון (PCA) למדידת חלבון: אינטראקציות חלבון 5.

איור 2
איור 2. ITSN PI3K ו-C2β צורה מורכבת BiFC. א VN-tagged ITSN היה שותף tranfected עם VC-tagged PI3K C3β-WT או תחום פרולין עשיר מוטציה (PI3K-C2β-PA). ITSN ו-WT PI3K C2β צורה מורכבת (ירוק). CFP (אדום) שימש שליטה transfection ב כתם המערבי בוצעה להפגין ביטוי שווה של בונה. VC-tagged בונה מתויגים HA.

טבלה 1
טבלה 1. ישנם מספר וקטורים התואמים BiFC. YN155: 1-155aa של YFP; YC155: 155-238aa של YFP; YN173: 1-172aa של YFP; YC173, 173-238aa של YFP; VN155: 1-154aa של ונוס; VC155: 155-238 של ונוס; VN173: 1-172aa של ונוס; VC173: 173-238aa של ונוס; CN155 1-154aa של CFP; CC155-155 238aa של CFP, GN173: 1-172aa של ה-GFP, CitN155: 1-155aa של סיטרין, CitC155: 155-238aa של סיטרין, CitN173: 1-172aa של סיטרין, CitC173: 173-238aa של סיטרין, CerN173: 1-172aa של Cerulean 2,3,9.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

BiFC היא שיטה מצוינת חזותי חלבון: אינטראקציות חלבון בתאים שלמים בקביעת לוקליזציה subcellular של קומפלקסים אלה. היתרונות של BiFC הן כי רק חלבונים אינטראקציה הם פלורסנט, אינטראקציות חולף הם התייצבו, שלאחר עיבוד של הנתונים הדמיה היא מינימלית. שני החסרונות של שיטה זו הינם זמן ההבשלה של fluorophore ואת ההפיכות של מורכבות fluorophore. תחת יישומים מסוימים ההפיכות זה יכול לשמש יתרון. לדוגמה, ניתן להשתמש אנזים ו activator של אנזים במתחם BiFC, וכתוצאה מכך הפעלה מכונן. אז אפשר לקבוע מה חלבונ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

אין ניגודי אינטרסים הכריז.

תודות

ITSN, PI3K-C2β ו וקטורים לשלוט בשימוש בפרוטוקול זה זמינים המחברים על פי דרישה, עבור לא מסחריות בלבד. המחברים מבקשים להודות לד"ר צ'אנג הו דנג עבור חביב במתן ייעוץ ו ריאגנטים השתמשו בהקמת פרוטוקול BiFC במעבדה O'Bryan. Kaw נתמך על ידי מימון של ג'רום קרן לז'ן. עבודה במעבדה O'Bryan נתמך על ידי תרומות של (HL090651) NIH, DOD (PR080428), קרן Baldrick סנט, ואת ג'רום קרן לז'ן.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
DMEMCellgro10-013
סרום בקר עוברי (Fetal bovine serum)Cellgro35-011-CV
צלחות מיקרו-בארים עם תחתית זכוכיתMatekP35G-1.5-14C
צלחות 6-באריFalcon BD35-3846
LipofectamineInvitrogen18324020
PBSCellgro21-031-CV
ParaformaldehydeSigma-AldrichP6148
מיקרוסקופ קונפוקאליCarl Zeiss, Inc.LSM510 META

מקורות

  1. Kerppola, T. K. Visualization of molecular interactions by fluorescence complementation. Nat Rev Mol Cell Biol. 7, 449-456 (2006).
  2. Shyu, Y. J., Liu, H., Deng, X., Hu, C. D. Identification of new fluorescent protein fragments for bimolecular fluorescence complementation analysis under physiological conditions. Biotechniques. 40, 61-66 (2006).
  3. Hu, C. D., Chinenov, Y., Kerppola, T. K. Visualization of interactions among bZIP and Rel family proteins in living cells using bimolecular fluorescence complementation. Mol Cell. 9, 789-798 (2002).
  4. Tsien, R. Y. The green fluorescent protein. Annu Rev Biochem. 67, 509-544 (1998).
  5. Michnick, S. W., Remy, I., Campbell-Valois, F. X., Vallee-Belisle, A., Pelletier, J. N. Detection of protein-protein interactions by protein fragment complementation strategies. Methods Enzymol. S328, 208-230 (2000).
  6. Michnick, S. W., MacDonald, M. L., Westwick, J. K. Chemical genetic strategies to delineate MAP kinase signaling pathways using protein-fragment complementation assays (PCA). Methods. 40, 287-293 (2006).
  7. Piston, D. W., Kremers, G. J. Fluorescent protein FRET: the good, the bad and the ugly. Trends Biochem Sci. 32, 407-414 (2007).
  8. Ciruela, F. Fluorescence-based methods in the study of protein-protein interactions in living cells. Curr Opin Biotechnol. 19, 338-343 (2008).
  9. Hu, C. D., Kerppola, T. K. Simultaneous visualization of multiple protein interactions in living cells using multicolor fluorescence complementation analysis. Nat Biotechnol. 21, 539-545 (2003).
  10. Martin, N. P. Intersectin regulates epidermal growth factor receptor endocytosis, ubiquitylation, and signaling. Mol Pharmacol. 70, 1643-1653 (2006).
  11. Das, M. Regulation of neuron survival through an intersectin-phosphoinositide 3'-kinase C2beta-AKT pathway. Mol Cell Biol. 27, 7906-7917 (2007).
  12. Mohney, R. P. Intersectin activates Ras but stimulates transcription through an independent pathway involving. JNK. J Biol Chem. 278, 47038-47045 (2003).
  13. Tong, X. K., Hussain, N. K., Adams, A. G., O'Bryan, J. P., McPherson, P. S. Intersectin can regulate the Ras/MAP kinase pathway independent of its role in endocytosis. J Biol Chem. 275, 29894-29899 (2000).
  14. Adams, A., Thorn, J. M., Yamabhai, M., Kay, B. K., O'Bryan, J. P. Intersectin an adaptor protein involved in clathrin-mediated endocytosis, activates mitogenic signaling pathways. J Biol Chem. 275, 27414-27420 (2000).
  15. O'Bryan, J. P., Mohney, R. P., Oldham, C. E. Mitogenesis and endocytosis: What's at the INTERSECTIoN? Oncogene. 20, 6300-6308 (2001).
  16. Shyu, Y. J., Suarez, C. D., Hu, C. D. Visualization of AP-1 NF-kappaB ternary complexes in living cells by using a BiFC-based FRET. Proc Natl Acad Sci U S A. 105, 151-156 (2008).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

Western Blot
השלמה Fluorescence bimolecular
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.