$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
ניקוטיאנה benthamiana צמחים גדלים בחדר בקרת טמפרטורה צמיחה של 25 מעלות צלזיוס. עלים בריא לגמרי מורחבת של 3-6 צמחים בשבוע הישן משמשים.
טיפ: תוצאות טובות יותר מתקבלים באמצעות עלים המתהווה
1. Agrobacterium פרוטוקול חדירה חולף:
יום 1
- LB Streak / ריפמפיצין (25 מיקרוגרם / מ"ל) / Kanamycin (100 מיקרוגרם / מ"ל) צלחות אגר עם מניות של גליצרול Agrobacterium tumefaciens (זן LBA4404) המכיל את הווקטורים המתאימים עם הגן (ים) להיות assayed למוות התא המכיל את וקטור את הקלטת גאס תחת מקדם מכוננת. תמיד כוללים בקרת וקטור ריק כביקורת שלילית.
- לדגור על 28 מעלות צלזיוס למשך 2 ימים.
יום 3
- לחסן 2 מ"ל של LB המכיל ריפמפיצין (25 מיקרוגרם / מ"ל) ו Kanamycin (100 מיקרוגרם / מ"ל) עם מושבת יחיד מתוך כל LB / ריפמפיצין / Kanamycin צלחת מפוספס בעבר.
- דגירה כל תרבות על ידי רועדת על 28 מעלות צלזיוס למשך 24 שעות עד 200 סל"ד צפיפות הגידול המרבי.
טיפ: clumping הוא ציין לפעמים, שבו תרבויות מקרה צריך להיות resuspended ביסודיות (כלומר pipetting למעלה ולמטה) לפני שתמשיך.
יום 4
- לאחר דגירה, להגביר את עוצמת הקול הכולל 10 מ"ל עם LB טרי (המכיל את האנטיביוטיקה המתאימה) acetosyringone (25 מיקרומטר הסופי ריכוז).
- דגירה כל תרבות על ידי רועדת על 28 מעלות צלזיוס למשך 16 שעות.
יום 5
- למחרת לשטוף כל תרבות פעמיים על ידי הוספת 10 מ"ל (לא מוסיפים acetosyringone) בינוני הסתננות (10 mM MgSO 4 0.7 H 2 O, 9 מ"מ MES, pH 5.6) ו צנטריפוגות XG ב 4000 ל 10 דקות בטמפרטורת החדר.
- לאחר השלב הסופי צנטריפוגה, resuspend כל התרבות בינוני 5 מ"ל חדירה המכילה acetosyringone (100 מיקרומטר).
- מדוד את OD 600nm, מדידות בין 0.1 ו 0.9 קבילים.
טיפ: OD 600nm של נמוך כמו 0.1 שימשו ללא בעיה, לעומת זאת, גבוה מכנסי הש"כ עשוי להניב תוצאות יותר עקביות. - דגירה התרבויות במשך 3 יותר שעות כדי להכין את התרבויות Agrobacterium לזיהום.
- מערבבים תרבויות המכיל את הגן (ים) להיות מנותח שליטה שלילית (Agrobacterium המכיל את וקטור ריק) ביחס של 1:1 עם התרבות המכיל את הקלטת גאס.
- חדור את הצד abaxial (תחת) של עלים חדשים המתעוררים באמצעות מ"ל 1 מחט המזרק פחות (איור 1).
טיפ: חדור הן תערובת בקרה שלילית (וקטור ריק + קלטת גאס) ואת תערובת המכילה את הגן להיות assayed (גן x + קלטת גאס) על העלים מנוגדים של אותו צמח. שימוש בצמחים בשלושה עותקים עבור כל טיפול. - 3 ימים לאחר חדירת הבלו הסתננו עלים assay ביטוי חלבון גאס.
2. Assay Histochemical גאס
יום 8
- אבק לחדור בינוני X-gluc המצע לתוך העלים נכרת.
- דגירה בחושך בטמפרטורת החדר למשך הלילה או עד כתמים כחולים ברורים מופיע.
יום 9
- לשטוף במים distillated.
- דגירה באתנול 70% עד כלורופיל מוסר, ואז להעביר מים מזוקקים שוב. ראייה להעריך רמות גאס הביטוי.
3. ספל Fluorometric assay:
יום 8
- לבודד חלבון הכולל ידי שחיקה דיסקים עלה הסתננו במכתש באמצעות חנקן נוזלי. הוספת 100 UL של חיץ מיצוי גאס (50 mM NaPi pH 7.0, 10 mM EDTA, 0.1% Triton X-100, 0.1% N-lauroylsarcosine מלח נתרן, β-mercaptoethanol (0.7 μl / ml), תוך שמירה על מדגם על הקרח.
- צנטריפוגה ההשעיה ב g 14,000 עבור 5 דקות ב 4 ° C ולקחת supernatant כמו חלבון מסיס מוחלט.
- מדידת ריכוז באמצעות nanodrop בהתאם להוראות היצרן.
- התאם את ריכוז החלבון 100 מיקרוגרם של חלבון מסיס סך כל דגימה באמצעות חיץ גאס החילוץ.
- הוסף המצע ספל (4-methylumbelliferyl-β-D-glucuronide הידראט) שהוכנו חיץ מיצוי גאס לריכוז סופי של 2 מ"מ. נפח כולל של 100 μL לדגימה (חלבון + המצע ספל) צריך להספיק.
- דגירה התגובות עבור שעה 1 ב 37 ° C.
- עצור תגובות על ידי הוספת 800 μl של גאס להפסיק חיץ (0.2 M Na 2 CO 3).
- מדידת הקרינה באמצעות קורא צלחת באורך גל 365 ננומטר עירור של אורך הגל פליטה של 455 ננומטר ולהשוות ערכים עקומת תקן MU. דווח על רמות של פעילות גאס כסך MU / מיקרוגרם חלבון מסיס nmol / min.
4. מניות פתרונות:
- Acetosyringone (1 ז) מניות (FW = 196.2 גרם) תת> - 0.981 גרם ב 5 מ"ל של DMSO
- Kanamycin (100 מ"ג / מ"ל) מניות - להכין ב DH 2 0 - מסנן לעקר
- ריפאמפיצין (25 מ"ג / מ"ל) מניות - להכין DMSO
- לוריא-Bertani (LB) צמיחה נוזלי התקשורת: (1 ליטר)
1% (w / v) bacto-tryptone, 10 גרם
0.5% (w / v) bacto, תמצית שמרים, 5 גרם
170 נתרן כלוריד mM 10 גרם
pH - 7 - Acetosyringone (25 מיקרומטר) = 25 μl של מניות 1 M בנפח סופי של 1 מ"ל
- בינוני הסתננות: (1 ליטר)
10 mM MgSO 4 0.7 DH 2 0 (FW = 246.48 גרם), 2.4648 גרם
9 מ"מ MES (FW = 213.25 גרם), 1.91925 גרם
pH - 5.6 - Acetosyringone (100 מיקרומטר) = 100 μl מלאי 1M בנפח סופי של 1 מ"ל
- גאס הפקת הצפת
50 מ"מ NaPi pH 7.0, 10 mM EDTA, 0.1% Triton X-100, 0.1% N-lauroylsarcosine מלח נתרן, β-mercaptoethanol (0.7 μl / ml) - 2x חיץ פוספט
לאא 0.2M 2 PO 4 ו - 0.2 M Na 2 HPO 4 pH 7 - X-Gluc המצע פתרון
ממיסים 1 מ"ג של 5-bromo-4-כלורו-3-BD-indolyl glucuronide (X-Gluc) ב 0.1 מ"ל מתנול. הוסף 1 מ"ל חיץ 2x פוספט, אשלגן 20 μl 0.1M ferricyanide, 10μl טריטון X-100 10% ו 850 μl מים distillated.
5. נציג התוצאות:
בעקבות פרוטוקול זה, אובדן ביטוי גאס צפוי כאשר מתרחש מוות של תאים. אנחנו הבענו את הגן בעת ובעונה אחת הכתב, β-glucuronidase (גאס) עם חבר של ארבידופסיס Cyto-המגן Bcl-2 Associated athanoGene (שקית) משפחה. אנו שיתוף הסתננו נ benthamiana עלים עם קלטת BAG 35S מונע הביטוי וקטור גאס pCAMBIA 2301 באמצעות LBA4404 Agrobacterium זן. כפי שמוצג בתרשים 2, עלייה גלוי מכתים גאס נצפתה בעקבות חדירה זו. לעומת זאת, כאשר ידוע הפרו אפופטוטיים ממשפחת Bcl-2 BAX היה בשימוש, הפחתה ניכרת של מכתים גאס נצפתה (איור 2). בשני המקרים הללו, הביטוי גאס היה שונה בעליל לעומת שליטה. עם זאת, כאשר ההבדל ביטוי בולט פחות, מבחני ספל fluorometric יכול להתבצע על quanitate ביטוי גאס.
באיור 1. דוגמה חדירה תערובת Agrobacterium של הצד abaxial נ benthamiana עלים 1 מ"ל באמצעות מחט המזרק פחות.
איור 2. וקטור גאס היה שותף לידי ביטוי נ benthamiana עלים עם הגן מוות אנטי, לבין inducer ידוע של מוות של תאים. רמות גאס הושוו לשלוט וקטור ריק (גאס שליטה).