Live-תא הדמיה של תאים מבשר חושי האיברים אינטקט תסיסנית גלמים

סיכום

בסרטון הזה, אנו מתארים שיטת הדמיה של תא חי להתחלק סימטרית חושי אבי איברים ותאי אפידרמיס ב שלם תסיסנית גלמים

תקציר

מאז גילויו של חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP), חל שינוי מהפכני השימוש הדמיה לחיות תאים ככלי להבנת המנגנונים הביולוגיים הבסיסיים. התקדמות מרשימה כבר בולט במיוחד תסיסנית, אשר נרחב ערכת כלים של מוטנטים קווי מהונדס מספק מודל נוח ללמוד מבחינה אבולוציונית, שימור מנגנונים ביולוגיים התפתחותיים התא. אנחנו מעוניינים להבין את מנגנוני התא לשלוט בגורל מפרט במערכת למבוגרים העצבים ההיקפית (PNS) ב תסיסנית. זיפים כי כיסוי ראש, חזה, בטן, רגליים וכנפיים של הזבוב הבוגר הם איברים mechanosensory הפרט, נחקרו כמערכת מודל להבנת המנגנונים של Notch תלויי החלטות גורל התא. חושי מבשר איבר (SOP) תאים של microchaetes (או זיפים קטנים), מופצים ברחבי האפיתל של בית החזה גלמי, והם שצוין במהלך 12 השעות הראשונות לאחר תחילת pupariation. לאחר מפרט, התאים מתחילים להתחלק SOP, מבודד את גורל התא הקובע Numb לתא בת אחת במהלך מיטוזה. פונקציות כמו Numb מעכב תאים אוטונומיים של מסלול איתות Notch.

כאן, אנו מציגים שיטה לעקוב אחר הדינמיקה חלבון בתא SOP והצאצאים שלה בתוך בית החזה גלמי שלמים באמצעות שילוב של רקמות ספציפיות Gal4 נהגים GFP-tagged חלבונים ^1,2 היתוך. טכניקה זו יש יתרון על פני רקמת קבוע או תרבותי explants משום שהיא מאפשרת לנו לעקוב אחר התפתחות שלם של איבר מן המפרט של מבשר העצבית לצמיחה בידול הטרמינל של האיבר. מכאן ניתן לתאם ישירות לשינויים בהתנהגות התאים לשינויים בידול סופנית. יתר על כן, אנו יכולים לשלב את טכניקת דימות לחיות עם ניתוח פסיפס עם סמן תא מערכת repressible (MARCM) כדי להעריך את הדינמיקה של החלבונים המתויגים ב SOPs mitotic בתנאים מוטציה או wildtype. באמצעות טכניקה זו, אנו ואחרים חשפו תובנות הרומן לתוך ויסות חלוקת התא אסימטרי הבקרה של הפעלת Notch איתות בתאי SOP (דוגמאות כוללות הפניות ^{1-6,7, 8).}

פרוטוקול

החומרים הדרושים: Dissection סטריאו מיקרוסקופ, פעמיים צדדי קלטת, שקופיות מיקרוסקופ coverslip סטנדרטיים, מלקחיים דיסקציה (בגודל 5 או 5.5), מברשת עם זיפים רכים, ואקום סיליקון גריז, מזרק 5cc, נייר Whatman, confocal או מיקרוסקופ epifluorescence עם המצלמה תמונה דיגיטלית רכישת התוכנה.

1. גלמי Dissection

1. הגדרת לחצות (באמצעות שילוב הולם של קו Gal4 ו-GFP חלבון היתוך מתויג תחת שליטה כטב"מ) או זבובים ממלאי מקום אתם רוצים תמונה צלוחיות טרי מספר על 25 ° C.
2. תאים SOP בדרך כלל מתחילים להתרבות על החזה גלמי בגיל שמונה עשרה שעות לאחר תחילת pupariation, ולכן אנו לבחור גלמים "לבן" ממלאי לטוס לחצות המתאימים. לבן גלמים יש מורפולוגיה גלמי, אבל יש מקרה גלמי חסרות צבע, המציין כי יש pupariated תוך שעה.
3. המתן כ 18 שעות.
4. מקום חתיכת סרט דו צדדית על גבי השקופית. איסוף גלמים ו לדבוק המקרה גלמי לקלטת דו צדדית עם הצד הגחוני למטה. לתפוס את הקצה של operculum (את הפתח העגול בקצה הגב הקדמי של המקרה גלמי) עם המלקחיים
5. הרם בעדינות, להסיר למחוק את operculum, וחשף את הראש של הזבוב לא בשלה.
6. השתמש במלקחיים כדי להתחיל לקרוע בצד של המקרה גלמי. הרם את הבטן של המקרה גלמי מהצד קרוע ולהביא אותו אל הצד השני, או להסיר אותה לחלוטין או לצרף אותה קלטת, לחשוף את החזה החלק הקדמי של הבטן. ( הערה: יש פער בין לטוס בפיתוח המקרה גלמי. להיזהר לא לנקב את לעוף כמו קיר של התיק נקרע.)
7. בגין קיצוץ יחד באותו צד של המקרה גלמי לקראת סוף האחורי. שוב, להיזהר לא לנקב את לעוף. משוך את המקרה גלמי לצד השני של הזבוב ולחץ אותו על גבי קלטת דו צדדית. הבטן צריכה להיות עכשיו נחשף במלואו. מניחים את מברשת עם זיפים רכים ישירות מתחת לראש של זבוב. לאחר זבוב תקוע על המברשת ללא במקרה גלמי, להשתמש במברשת בעדינות להרים את להתעופף השקופית.

2. גלמי הרכבה

לאחר דיסקציה, גלמים הם רכובים אז בין שקופיות coverslip:

8. גלמים מבודד להסיר מקרה לאחר מכן ניתן דגש על מרכז צד שקופיות הזכוכית הגב למעלה.
9. שימוש מזרק 5 סמ"ק מלא גריז ואקום סיליקון, למרוח שכבה אחידה של שומן סביב מסגרת Whatman. שכבת שומן צריך להתאים coverslip (איור 1) ואת עובי צריך להיות רק קצת יותר מאשר קוטר גלמי.
10. מקום טיפה קטנה של מים (1 μl) על מרכז coverslip 22X22 מ"מ והמקום coverslip על הכנת מעל כזה טיפה את המגעים קטן המים משטח אתה רוצה notum התמונה, במקרה זה). דחיסת בעדינות כדי ליצור חותם שלמה של גריז ואקום משטח מגע שטוח בין coverslip ו לציפורן גלמי.
11. Prep אז יכול להיות צילמו על microcopes הפוך או ישר, או באמצעות epifluorecence, confocal (סריקת לייזר או ספינינג סוג דיסק) או שני הפוטונים confocal. אם אתה זהיר, זבובים בוגרים ניתן לשחזר לאחר מספר ימים.

3. נציג תוצאות:

שימוש קו SOP ספציפי Gal4 ( Neuralized-Gal4) חצה ה-GFP לחלבונים מתויג לתייג את ציר mitotic (טובולין או טאו-GFP) או חלבונים היסטון (H2B-GFP), ניתן לראות מטוס חלוקה של חלוקת התא SOP, אורכו של מחזור התא, או מספר mitotic חטיבות באמצעות זמן לשגות הדמיה ⁹. חלבונים היתוך אחרים כי היעד אברונים הסלולר כגון ראב-GTPases לסמן תאים endocytic שונים (Rab5-GFP עבור מוקדם endosomes או Rab11 GFP למיחזור endosomes) או חלבונים חשוב בוויסות איתות Notch (Numb-, שותף של Numb-GFP, או Sanpodo -GFP) יכול להניב תובנות חשובות המנגנונים של חלוקת התא אסימטרי חלבון סחר קרום ^2,3,7,10,11.

איור 1: דיסקציה גלמי ועל הרכבה. א שלב אחר שלב תמונות להראות את ההליך כדי להסיר את המקרה גלמי ולהכין גלמים שלם עבור דימות תא הרכבה ולחיות. גלמים יוסרו מן הבקבוקון והניח, בצד הגבי מעלה, בקלטת מקל כפול מצורף זכוכית שקופית. בעמודה הראשונה, הסרת operculum וקרע בצד של המקרה גלמי. בעמודה השנייה, הסרת מקרה גלמי מאזור החזה ועל הבטן. גולם חופשי אז הוא הרים מן המקרה גלמי בעזרת מברשת זיפים רכים. ב הרכבה גלמים בין שקופיות coverslip. פופה ממוקם בצד הגבי על שקופיות הזכוכית, מוקף מסגרת לחלח נייר Whatman. חרוז רציפה של שומן ואקום סיליקון extruded מתוך פונקציות מזרק 5cc לאטום את שילוב שקופיות coverslip, הגנה על גולם מן dessication ומרומם coverslip כך נשענת בעדינות על החזה גלמי. טיפה קטנה של מים (1 μl) בממשק שבין coverslip ו לציפורן החזה משפר את איכות התמונה באופן משמעותי בעת שימוש למטרות טבילה (מים או שמן). לחץ כאן כדי להציג תמונה מוגדלת.

איור 2: תמונות הנציג של תאים SOP חיים מובחן אברי החישה חיצוני באמצעות נלקח לנתיחה גלמי שלנו גובר ההליך.. תמונות מופק סדרת זמן של תא SOP mitotic להביע אקטין-GFP חלבון היתוך תחת שליטה של Neuralized- Gal4 ( Neur- Gal4/UAS-actin-GFP), שים לב הצטברות של קליפת המוח אקטין על תלם מחשוף (1 image / כל 2 דקות). B. תאים SOP הבת שיתוף להביע שותף Numb-RFP (אדום) ו-GFP Rab5 מונע על ידי Neuralized- Gal4, שים לב הפצה אסימטרית של Pon-RFP בתא בת אחת (pIIb) והפצה של המוקדמות endosomes הן לתאי הבת. C. טיוח נפח Z-סדרת נלקח מובחן של אברי החישה חיצוני בשלב מאוחר גלמי. מבנים לציפורן, כגון mechnosensory זיפים ושערות אפידרמיס מתגלים על ידי לציפורן autofluorescence (אדום). בנוסף, השתמשנו במערכת MARCM להביע Lgl-GFP (מונע על ידי Neuralized- Gal4) משנה של חושי מבשר התאים איבר (ירוק). (תמונות אלה נרכשו כל שימוש C1 Nikon סריקת מיקרוסקופ confocal באמצעות המטרה 60x 1.45 NA)

דיון

בסרטון הזה, אנו ממחישים טכניקה בידוד גובר תסיסנית Pupaefor הדמיה תא חי של תאים SOP על notum גלמי. הסרת גלמים ממקרה גלמי דורש יד יציבה, כלים מתאימים, וכמה בפועל, אבל קל ללמוד. חשוב כי ההיערכות של גלמים להיעשות במדויק, על מנת להבטיח את הקלות היחסית של הניתוח ואת לתפוס את שלב הפצת פיתוח SOP. רכוב פעם, גלמים תמשיך לפתח בין שקופיות coverslip, וברוב המקרים, יגיע השלב הבוגר pharate, ובסופו של דבר eclose. מניסיוננו, התא ניתן הדמיה במשך כמה שעות. טכניקה זו הרכבה אינו מוגבל תצפית של תאים PNS מבשר על החזה גלמי, אך ניתן להשתמש בהם כדי להמחיש כל התאים קרוב לפני השטח לציפורן ונגיש המטרה מיקרוסקופ, (יש לציין כי התצפיות נעשות בשלב שבו המקרה גלמי ניתן להסיר בלי להרוג את גולם, בדרך כלל על 10 עד 14h לאחר היווצרות puparium). יש לנו חלבונים junctional דמיינו בהצלחה, חלבונים cytoskeletal וסחר הרגולטורים שלפוחית ​​בתאי האפיתל גלמי (נתונים שלא פורסמו).

טכניקת הרכבה גלמי אפשרה לנו גם לפתח שיטה למבנים תמונה cuticular ב גלמים בשלב מאוחר באמצעות מיקרוסקופ confocal סריקה, על מנת להמחיש את המורפולוגיה של mechanosensory זיפים ושערות אפידרמיס באמצעות autofluorescence הפנימי של לציפורן. תמונות אלה דומים micrographs סריקת אלקטרונים של לציפורן לעוף, אבל ניתן לרכוש מבעלי חיים, וכן לאפשר לנו לחזות בו זמנית cuticular מורפולוגיה וביטוי של ה-GFP פלואורסצנטי ^6,7,12.

חומרים

• נייר דבק מקל כפול
• זכוכית שקופית
• 18mmX18mm coverslip
• מצבטים
• Whatman נייר
• Dow Corning סיליקון גריז ואקום
• 5 מ"ל במזרק
• Pipetter
• Confocal או epifluorescence מיקרוסקופ