Method Article

התקן Gradient מניבות Microfluidic עבור ביולוגיה של התא

DOI:

10.3791/271

⸱

August 30th, 2007

 ,  ,  ,  ,  , 
1Harvard-MIT Division of Health Sciences and Technology, Massachusetts Institute of Technology; Center for Biomedical Engineering, Department of Medicine, Brigham and Women's Hospital

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אנו מתארים פרוטוקול עבור microfabrication של המכשיר שיפוע מניבות microfluidic כי ניתן להפיק הדרגתיים במרחב ובזמן ב microenvironment מוגדרים היטב. בגישה זו, המכשיר שיפוע מניבות microfluidic ניתן להשתמש כדי ללמוד נדידת תאים מכוונת, embryogenesis, ריפוי פצעים, ועל גרורות סרטניות.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ייצור ותפעול של המכשיר שיפוע מניבות microfluidic לחקר התנהגות תאית מתואר. פלטפורמה microfluidic הוא כלי ניסיוני המאפשר, כי זה יכול דווקא לתפעל זורם נוזל, לאפשר תפוקה גבוהה ניסויים, וליצור יציבות הדרגתיים ריכוז מסיסים. בהשוואה גנרטורים שיפוע קונבנציונלי, פולי (dimethylsiloxane) (PDMS) מכשירים microfluidic מבוסס יכול ליצור מעברים הדרגתיים ריכוז יציב של גורמי גדילה עם פרופילים מוגדרים היטב. הנה, פיתחנו פשוט שיפוע מניבות מכשירים microfluidic עם שלושה פתחי הכניסה נפרדת. שלושה microchannels לשלב אחד microchannel ליצור מעברים הדרגתיים ריכוז. היציבות ואת הצורה של הדרגתיים גורם גדילה אושרו על ידי והעמסת isothyiocyanate (FITC)-dextran עם משקל מולקולרי דומה גורם הגדילה באפידרמיס (EGF). שימוש המכשיר microfluidic, הראינו כי fibroblasts חשופים הדרגתיים ריכוז של EGF נדדו לעבר ריכוזים גבוהים יותר. התמצאות כיוונית של נדידת תאים ו תנועתיות של תאים נודדים הוערכו כמותית על ידי ניתוח התא מעקב. לפיכך, התקן זה שיפוע מניבות microfluidic עשוי להיות שימושי עבור לימוד וניתוח התנהגותם של תאים נודדים.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

א Microfabrication של המכשיר שיפוע מניבות microfluidic

  1. רקיק סי מטופל עם פלזמה החמצן מגיב (5 דקות ב 30W, Harrick מדעי, ניו יורק).
  2. Photoresist שלילית (SU-8 50, Microchem, MA) היא ספין מצופה בסל"ד 1000 דקות 1 על פרוסות סיליקון Si.
  3. רקיק הוא רך אפוי על 65 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות ולאחר מכן ב 95 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות על פלטה חמה.
  4. רקיק הוא נחשף לאור UV (200W) עבור 3 דקות דרך מסכה שקיפות עם גודל התכונה מינימלי של 30 מיקרומטר.
  5. רקיק הוא שלאחר אפוי על 65 מעלות צלזיוס במשך 1 דקות ו - 95 ב מעלות צלזיוס למשך 10 דקות.
  6. סי עובש הורים עם 100 ערוצי מיקרומטר עבה הוא פותח באמצעות SU-8 מפתח photoresist.
  7. רקיק המכיל microchannels מושם בצלחת פטרי,.
  8. תבניות פולי (dimethylsiloxane) (PDMS) (Sylgard 184) מיוצרים על ידי אלסטומר סיליקון ערבוב סוכן ריפוי (יחס 10:01).
  9. התערובת PDMS הוא שפך על עובש האב סי.
  10. עובש האב סי מושם על ייבוש ואקום כדי להסיר בועות במשך 10 דקות.
  11. PDMS נירפאים ב 70 ° C עבור 1 ~ 2 שעות.
  12. תבניות PDMS הן קילף מהתבנית האב סי.

ב ניסויית ההתקנה

  1. כניסת Cell, מוצא, וכן יציקת פתחי הכניסה של המכשיר PDMS מבוסס microfluidic הם חבט באמצעות הבוקרים חדה.
  2. מכשיר ו שקופיות הזכוכית (2 × 3 ס"מ) מודבקים באופן בלתי הפיך על ידי הפלזמה החמצן מגיב (5 דקות ב 30W, Harrick מדעי, ניו יורק).
  3. צינורות פוליאתילן (PE 20, בקטון Dickinon, MD) הוא מוכנס לתוך פתחי הכניסה יציקת של המכשיר microfluidic ומחוברים לאחר מכן משאבת מזרק.
  4. Isothiocyanate והעמסת (FITC)-dextran (MW = 10kD, 10 מיקרומטר, Sigma) ו חיץ (PBS, Invitrogen, CA) הם החדיר לתוך המכשיר microfluidic לאשר הדרגתיים יציבה בתוך המכשיר fluidic.
  5. תאי מטריקס (ECM) (כלומר, פיברונקטין) מצופה בתוך המכשיר microfluidic שעה 1 ב בחממה (37 ° C).
  6. תאים פיברובלסטים NIH 3T3 הם trypsinized ו ניתק.
  7. תאים ניתק נטענים לתוך המכשיר microfluidic (800 מיקרומטר רחב) בשעה צפיפות התא של 2 × 10 6 תאים / מ"ל.
  8. 2 מדיה מ"ל ו 50 ng / ml גורם צמיחה אפידרמיס (EGF), הוא החדיר לתוך מכשיר microfluidic להפקת הדרגתיים מסיסים באמצעות משאבת מזרק (0.05 μl / min).
  9. תאים הם בזמן אמת לנטר כל 5 דקות באמצעות מיקרוסקופ הפוכה (ניקון TE 2000).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

תאים שנחשפו הדרגתיים ריכוז יציב של EGF במכשיר microfluidic נדדו לעבר ריכוזים גבוהים יותר. התמצאות כיוונית של נדידת תאים, מדד chemotactic, תנועתיות של תאים נודדים נחקרו על ידי ניתוח התא מעקב. לכן, זו פלטפורמה שיפוע מניבות microfluidic יכול להיות שימושי עבור לימוד גרורות סרטן, embryogenesis, והכוונה האקסון.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Dextran-FITCReagentSigma-AldrichFD10SFluorescein isothiocyanate (FITC) מצומד-דקסטרן (10kD)
hr-EGFInvitrogen13247-051גורם גדילה אפידרמלי רקומביננטי אנושי
PDMSK.R. Anderson Co.2065622פולי (דימתילסילוקסן) (PDMS), דאו קורנינג סילגארד 184 (8.6 ליברות)
פוטו-רזיסט MicroChem Corp.SU-8 50
Si רקיקסיליקון רקיק, 4 אינץ'
צלחות
פטרי צינורות פוליאתילן BD BiosciencesPE 20
PBSInvitrogen
פיברונקטין
NIH 3T3 קותאי פיברובלסטים
מיקרוסקופNikon InstrumentsTE 2000
נגטיב תאים הפוך

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Jeon, N. L., Baskaran, H., Dertinger, S. K. W., Whitesides, G. M., Van de Water, L., Toner, M. Neutrophil chemotaxis in linear and complex gradients of interleukin-8 formed in a microfabricated device. Nat. Biotechnol. 20, 826-830 (2002).
  2. Lin, F., Nguyen, C. M., Wang, S. J., Saadi, W., Gross, S. P., Jeon, N. L. Effective neutrophil chemotaxis is strongly influenced by mean IL-8 concentration. Biochem. Biophys. Res. Commun. 319, 576-581 (2004).
  3. Chung, B. G., Flanagan, L. A., Rhee, S. W., Schwartz, P. H., Lee, A. P., Monuki, E. S., Jeon, N. L. Human neural stem cell growth and differentiation in a gradient-generating microfluidic device. Lab Chip. 5, 401-406 (2005).
  4. Saadi, W., Wang, S. J., Lin, F., Jeon, N. L. A parallel-gradient microfluidic chamber for quantitative analysis of breast cancer cell chemotaxis. Biomed. Microdevices. 8, 109-118 (2007).
  5. Chung, B. G., Park, J. W., Hu, J. S., Huang, C., Monuki, E. S., Jeon, N. L. A hybrid microfluidic-vacuum device for interfacing with conventional cell culture platform. BMC Biotechnol. 7, (2007).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Microfluidic DeviceGradient GenerationPDMS FabricationCell MigrationEGF ConcentrationFITC DextranPlasma BondingCell TrackingMicrochannel DesignSoluble Gradients

Related Articles