Dissection של הכליה דג הזברה למבוגרים

סיכום

כליות דג הזברה הוא ביתם של שני גזע / ובתאים כליות hematopoietic מבוגרים, מהווה הזדמנות מעולה ללמוד סוגי תאים אלה וצאצאיהם באורגניזם מודל החולייתנים. הנה, אנחנו מדגימים הליך לנתיחה מפורט המאפשר חוקר לזהות בניתוח להסרת הכליה דג הזברה למבוגרים, אשר יכול לשמש עבור יישומים כגון בידוד התא, השתלה, ומחקרים ביטוי וכליות / או אוכלוסיות תאים דם.

תקציר

חוקרים העוסקים בתחום המתפתח של הביולוגיה גזע בוגרים תא מבקשים להבין את האותות המווסתים את ההתנהגות והתפקוד של בתאי גזע במהלך הומאוסטזיס תקין מדינות המחלה. ההבנה של בתאי גזע בוגרים יש השלכות רחבות לכת לעתידה של רפואה רגנרטיבית ^1. כך, למשל, ידע טוב יותר על הביולוגיה תא גזע בוגרים יכולים להקל את העיצוב של אסטרטגיות טיפוליות שבה איברים מופעלות לרפא את עצמם או אפילו יצירה של שיטות גידול איברים במבחנה כי ניתן להשתיל לבני אדם ^1. דג הזברה הפכה מודל בבעלי חיים רב עוצמה עבור המחקר של ביולוגיה של התא ² חוליות. יש כבר תיעוד וניתוח מקיף של ההתפתחות העוברית של דג הזברה ^3. רק לאחרונה המדענים ביקשו מסמך האנטומיה למבוגרים טכניקות כירורגיות לנתיחה ^4, כמו חלה התנועה מתקדמת בתוך הקהילה דג הזברה להרחיב את היישומים של האורגניזם זה מחקר ללימודי מבוגרים. לדוגמה, יש להרחיב את האינטרסים באמצעות דג הזברה כדי לחקור את הביולוגיה של אוכלוסיות תאים גזע בוגרים ולהפוך מודלים בוגר ומתוחכם של מחלות כגון סרטן ^5. מבחינה היסטורית, בידוד של הכליה מבוגר דג הזברה כבר סייעה לחקר hematopoiesis, כמו הכליות הוא המיקום האנטומי של ייצור הדם תא דגים ^6,7. כליה מורכבת יחידות נפרון פונקציונלי למצוא הסדרים arborized, מוקף ברקמת hematopoietic כי הוא מפוזר ברחבי החללים שביניהם. המרכיב hematopoietic מורכב בתאי גזע hematopoietic (HSCs) וצאצאיהם המאכלסים את הכליה עד סופני להבדיל ^8. בנוסף, הוא מעריך כעת כי קבוצה של גזע / ובתאים הכליה (RPCs) מאכלסים גם את האיבר כליות דג הזברה ולאפשר גם התחדשות וצמיחה כליות, כמו שנצפה מיני דגים אחרים ^9-11. לאור הגילוי החדש הזה, את הכליה דג הזברה הוא אחד האיברים כי הבתים המיקום של שתי הזדמנויות למבוגר תא גזע לימודי הביולוגיה. ברור כי שאלות מצטיינים רבים יכול להיות מוגש גם עם מערכת זו ניסיוני. כדי לעודד הרחבה של תחום זה, זה מועיל מסמך מפורט של שיטות הדמיה ואז לבודד את איבר מבוגר כליה דג הזברה. פרוטוקול זה מפרט הנוהל שלנו לנתיחה של הכליה מבוגר מחיות הן מבולבל וקבוע. Dissection של האיבר כליות יכול לשמש כדי לבודד ולאפיין בתאי גזע hematopoietic ו כליות וצאצאיהם באמצעות טכניקות כגון הוקמה היסטולוגיה, תא הקרינה מיון מופעל (FACS) ^11,12, פרופיל ביטוי ^{13,14, 11,15} ו השתלה. אנו מקווים כי הפצת פרוטוקול זה יספק לחוקרים את הידע כדי ליישם שימוש רחב יותר של מחקרים דג הזברה שבסופו של דבר ניתן לתרגם עבור יישום האדם.

פרוטוקול

1. Dissection של הכליה דג הזברה מבוגר ממדגם חיה מבולבל

1. בחר דג הזברה מבוגר בין גיל 3-6 חודשים לניתוח.
2. להרדים את הדגים על ידי הצבת אותו לתוך צלחת עם 0.2% Tricaine pH 7.0 למשך כ 4-5 דקות, צופים בקפידה לראות הזימים להפסיק לזוז הלב מפסיק לפעום.
3. בעזרת כף, להרים את הדג מהאמבטיה Tricaine כמות קטנה של פתרון, למזוג את הפתרון ומניחים בעדינות את החיה על מגבת נייר.
4. השתמש זוג מספריים חדות לנתיחה כדי להסיר את הראש של החיה, ביצוע חתך ממש מאחורי operculum הזימים (איור 1, נתיב). מחק את הראש במיכל פסולת Biohazard.
5. השתמש במספריים לנתיחה כדי לפתוח את הגוף של החיה, על ידי ביצוע חתך ארוך הגחון, החל בראש וסיום על הזנב בבסיס של סנפיר הזנב (איור 1, B נתיב).
6. מוציאים את האיברים הפנימיים של החיה באמצעות פינצטה לנתיחה / מלקחיים, ומכניסים אותם פסולת Biohazard. היזהר שלא לצחצח את הקיר הגוף הגב, כמו זה המיקום של הכליה (איור 2). אם בחרת דג נקבה, תצטרך סקופ ביצים מתפתחות מתוך חלל הגוף, אשר ניתן לעשות זאת בקלות בעזרת זוג זווית של מלקחיים או פינצטה.
7. השתמש במחטים לנתיחה להצמיד לפתוח את קירות הגוף מגש לנתיחה, וזווית הסיכות כך הכליה ניתן דמיינו. כליות יהיה בעל צורה אופיינית (ראש, גזע / אוכף, זנב) ואת צבע, להיות משובצים פיגמנטציה בגוון שחור (איור 2). אתה יכול גם לראות את אבי העורקים מלא דם היקפיים, המפעילה את קו האמצע של מבנה האיבר.
8. שימוש במלקחיים בסדר לנתק את הכליה מן הקיר הגוף הגב, באמצעות זוג מלקחיים להרים את הכליה כפי שאתה להפריד בין איברים רקמות החיבור העומדים בבסיס זה.
9. בעדינות למקום כליה לתוך הרכב הרצוי להמשך הלימודים תא חי, כגון צינור המכיל microcentrifuge 1x PBS להכנת FACS.

2. הכנה דיסקציה של הכליה דג הזברה מבוגר ממדגם חיים קבוע

1. הכן פתרון של PBST paraformaldehyde/1X 4%. מרתיחים את הפתרון לפזר את PFA לתוך תמיסה, ואז לצנן את התערובת עד 4 ° C ולהוסיף dimethylsulfoxide 0.1%. היו לנו את ההצלחה הרבה ביותר עם שימור רקמת משימוש טריים פתרונות PFA בניגוד aliquots קפוא. בצע פתרון מספיק כדי להטביע את דג הזברה מבוגר במהלך לנתיחה.
2. מלא מגש דיסקציה עם פתרון קיבעון מספיק כדי להטביע את דג הזברה מבוגר במהלך הניתוח. אנו מבצעים את הצעדים הבאים עם מגש זה ממוקם מתחת למיקרוסקופ, אשר ניתן למקם במנדף כימי כדי למזער את החשיפה ריחות קיבעון.
3. בחר דג הזברה מבוגר בין גיל 3-6 חודשים לניתוח.
4. להרדים את הדגים על ידי הצבת אותו לתוך צלחת עם 0.2% Tricaine pH 7.0 למשך כ 5 דקות, צופים בקפידה כדי לראות את הזימים ולהפסיק את פעימות הלב.
5. בעזרת כף, להרים את הדג מהאמבטיה Tricaine כמות קטנה של פתרון, למזוג את הפתרון ומניחים בעדינות את החיה על מגבת נייר.
6. השתמש זוג מספריים חדות לנתיחה כדי להסיר את הראש של החיה, ביצוע חתך ממש מאחורי operculum הזימים (איור 1, נתיב). מחק את הראש במיכל פסולת Biohazard, ומיד במקום חיה לתוך מגש PFA המכילים את הנתיחה.
7. השתמש במספריים לנתיחה כדי לפתוח את הגוף של החיה, על ידי ביצוע חתך ארוך הגחון, החל בראש וסיום על הזנב בבסיס של סנפיר הזנב (איור 1, B נתיב), ולשמור על גוף שקוע חלקית במהלך את ההליך.
8. מוציאים את האיברים הפנימיים של החיה באמצעות פינצטה לנתיחה / מלקחיים, ומכניסים אותם פסולת Biohazard. היזהר שלא לצחצח את הקיר הגוף הגב, כמו זה המיקום של הכליה (איור 2).
9. השתמש במחטים לנתיחה להצמיד לפתוח את קירות הגוף, זווית סיכות כך הכליה ניתן דמיינו. כליות יהיה בעל צורה אופיינית (ראש, אוכף, זנב) ואת צבע, להיות משובצים פיגמנטציה בגוון שחור (איור 2). אתה יכול גם לראות את אבי העורקים מלא דם היקפיים, המפעילה את קו האמצע של מבנה האיבר.
10. תקן את המדגם לילה, הצבת את המגש 4 ° C כשתסיים עם סידור דגימות הרצוי.
11. למחרת, להסיר את הפתרון PFA ממגש ולהחליף PBST 1x.
12. שימוש במלקחיים בסדר בזהירות לנתק את הכליה מן הקיר הגוף הגב, באמצעות זוג מלקחיים להרים את הכליה כפי שאתה להפריד בין איברים רקמות החיבור העומדים בבסיס זה. רקמות הכליה יהיה רך וגמיש מן DMSO בפתרון מקבע, כך שניתן לנתח את האיבר כליות כולו בחתיכה אחת.
13. שימוש רחבנשא pipet להעביר למקום כליה לתוך צינור microcentrifuge.
14. כליות כעת ניתן לבצע עיבוד נוסף הר היסטולוגית או כל באתרו ביטוי במחקרים הגן מבוסס על מחקר הרצוי.

3. נציג התוצאות:

השלבים ניתח באיור 1 מצביעים על הליך הנתיחה. כליה ניתן לזהות המבוססת על הצורה האופיינית שלו צבע, ומיקום אנטומי על הקיר הגבי של חלל הגוף של בעל החיים, כפי שמוצג באיור 2. לאחר דיסקציה של הר קבוע המדגם, כליה שלמה הכלאה באתרו ניתן להשתמש כדי למקם את הביטוי של הגן של עניין, כפי שמוצג באיור 3.

איור 1: נוהל המאפשר גישה ישירה לנתח את הכליה מבוגר דג הזברה. (A) הוא דג הזברה מורדמים גזור באופן הדרגתי (מסומן מספרים וחצים) לתת חוקר הגישה הקלה ביותר האיבר כליה מוחלטת. תמונות של חלל הבטן לפני (B) ואחרי (ג) להסיר את אברי הבטן.

איור 2:. ויזואליזציה של הכליה דג הזברה במדגם מבולבל בעקבות הסרת איברים בחלל הגוף, הכליות מופיע איבר יחיד, משוטח כי הוא חסיד אל הקיר הגבי הגוף דרך רקמות החיבור (א), ומאז schematized (ב) כדי להראות הצורה האנטומית שלו.

איור 3: הר שלמים באתרם הכלאות שבוצעו על האיבר מבוגר כל כליה. (א) cadherin17 תמלילי מזוהים ב אבובית של nephrons כליה למבוגרים, שהורחבה (א '). (ב) תעתיקים mafba הם נקודתיים הפרוקסימלי תא נפרון סוגי בכליות מבוגר (להשוות אבובית כולו בלוח). (ב' ) להציג מוגדל הביטוי mafba מגלה כי תמלילי מרוכזים במיוחד (P) של תאים podocyte הדם פילטר (glomerulus) ו אבובית מפותלת הפרוקסימלי (PCT).

דיון

בתאי גזע בוגרים הם מרכיבים דינמי חיוני לשמור על צורת גוף מבוגר ^1. בתאי גזע בוגרים יכולים גם לשמש כדי לנטרל את הנזק כי שהתהוו הגוף במצבי מחלה, ואת תפקוד לקוי או חוסר בתאי גזע בוגרים יכולים להוביל לירידה בתפקוד איברים היה מעורב לנהוג ממאירות סרטן ולתרום ההזדקנות. בתאי גזע בוגרים תערוכת הסלולר מאפיינים המבדילים אותם סוגי תאים מובחנים. לאחר חלוקת התא, בתאי גזע בוגרים מסוגלים התחדשות עצמית ואת הייצור של ובתאים כי בתורו יכול להצמיח צאצאים הבדיל ברורים. יש עניין רב בהבנת המסלולים המווסתים את גורל התא החלטות העוצמה של בתאי גזע בוגרים בגלל התפקידים החשובים שלהם הומאוסטזיס רקמות ^1. לדוגמה, מדענים רבים כיום מבקשים לזהות את האותות השונים לשמור על תא גזע בוגרים אוכלוסיות בנישה שלהם, או microenvironment המקצועית, ואיך זה נישה מושפע מגורמים הלחות.

למבוגרים בתאי גזע hematopoietic (HSCs) הם תאים pluripotent כי הדלק והתחדשות מתמדת של כדוריות דם בבעלי חיים ^8. Hematopoiesis הוא תהליך תוססת כי נמשכת ללא הרף במהלך חיי האורגניזם חוליות משום בוגרת הבדיל תא סוגי הדם הם קצרי חיים ולכן חייב להיות מתחדש באופן קבוע. כפי שהם מחלקים, HSCs לספק דרישה זו חיונית על ידי חידוש עצמית והפקת סדרה של אבות כי להצמיח erythroid, שושלות megakaryocyte, הלימפה ואת מיאלואידית. כל אחד מסוגי כדוריות הדם מבצעת פונקציות ייחודיות במחזור הדם, לרבות מתן חילוף הגזים ברקמות, דרך לאיטום פגיעות בכלי הדם באמצעות היווצרות קריש דם, או מנגנוני הגנה נגד פתוגנים הפולשים. בעוד HSCs הוכרו במשך שנים רבות, שפע של שאלות מרתקות נותרו ללא מענה על התאים האלה מדהים. מחקרים שנערכו לאחרונה זיהו subclasses של HSCs עם שונות לטווח ארוך עצמית חידוש נכסים, ואת הבהרה של רכיבים נישה אותות לווסת התנהגות HSC ^8. דג הזברה הוא עכשיו בין אבני היסוד של פרדיגמות מחקר hematopoiesis, בהתבסס על תכונות גנטיות מולקולריות של מודל זה החי ^8. מחקר ניצול דג הזברה הובילה לתובנות רומן על הביולוגיה HSC כי הם שמורים עם חוליות גבוהה כמו יונקים, תוך שימת דגש על הרלוונטיות ביו דם חקירות דגים ^8.

מבחינה היסטורית, הידע על HSCs סלל את הדרך עבור משלחות המבקשים לגלות אם אברי גוף אחרים מתוחזקים על ידי בתאי גזע בוגרים. רבים גזע בוגרים אוכלוסיות תאים מוערכים עתה להתקיים, הנעים על פני מבנים שונים מהמוח אל המעי, העור, שרירי השלד. המשך המאמצים בתחום בתאי גזע מבקשים לזהות כיצד בתאי גזע בוגרים אחרים גם סוגי תאים מובחנים יכול להציג עוצמה מוגברת במסגרות שונות.

לגבי הכליות, חלה הוויכוח הגדול בין nephrologists, האם בתאי גזע כליה קיימים ^16. ממצאים עצמאיים תיעדו אוכלוסיות של תאים כליות אצל יונקים שיש להם דרגות שונות של פוטנציאל ההתחדשות, אבל הבנה מלוכדת של דוחות אלה טרם הושג. מעניין לציין, כי יש ראיות חזקות כדי לתמוך ברעיון מיני דגים רבים בעלי תאים שיכולים וחסונה דלק התחדשות של nephrons פגום, כמו גם לצמוח nephrons חדש לחלוטין במהלך הבגרות ^9. מחקר שנערך לאחרונה זיהה את סימני ההיכר המולקולרי של בתאי גזע בוגרים כליה דג הזברה ^10,11, והדגימה את העוצמה העצמית חידוש אלה שנקרא גזע / ובתאים הכליה (RPCs) ^11. מחקרים עתידיים נחוצים על מנת לבדוק אם התאים כליה מקביל נמצאים היונקים. עם זאת, החקירות נמשכו על מנגנוני תאית ומולקולרית המווסתים RPCs דגים עשויים לספק תובנות לגבי האופן שבו מעללי משובי עלול להיות מגורה בכליות יונקים. ברור כי הרבה נשאר להיות מובן על RPCs, וכי כלים רבים כעת לרשות החוקר דג הזברה יכול להיות מיושם כדי להתמודד עם השאלות האלה מסקרן.

בפרוטוקול זה, אנו מתארים את השיטה שלנו לזיהוי דיסקציה אנטומית של הכליות דג הזברה מבוגר. צעדים חלופיים שניתן להשתמש בהם כדי לנתח את הכליה, כגון פתיחת חלל הבטן עם חתך הגחון באמצעות מספריים לנתיחה, אולם נתקלנו את ההצלחה הרבה ביותר בגישה כליה שלמה כאשר דופן הבטן הוא ניצח לפתוח את הראש מוסר. דם בכליות החוקרים כאחד המבקשים לבודד לעבוד עם סוגי תאים אלה יכולים להשתמש גם בשיטת לנתיחה. יצוין כי שיטת אנו מתארים עבור בידוד עובדg עם כליה הבוגרת דג הזברה הוא בהחלט לא רק מדענים שרוצים להמשיך שאלות בביולוגיה תא גזע בוגרים, כפי דיסקציה של איבר זה יכול להקל על מחקרים אלו חוקרים רודף חקירות בנושאים שונים, החל הפיזיולוגיה להזדקנות. יתר על כן, בשיטה זו ניתן בשילוב עם טכנולוגיות אחרות כגון transgenics, כדי מולקולרי תווית ולאחר מכן לטהר מחקר subpopulations דיסקרטית של כדוריות דם או כליה מן wildtype או מוטציה גנטית דג הזברה ^11. במבט קדימה, כגון תהליכי טיהור מפורט של סוגי גזע אב התא חיונית צובר ידע על איך ההתנהגות שלהם מוסדר, כמו בדיקות מבצעיות כגון השתלה או culturing אבי מהווים את הבסיס שלפיו העוצמה ואת זהותם של תאים אלה מוגדר. ההתקדמות בשיטות תרבות hematopoietic אבי לפתוח אפיקים חדשים רבים למחקר, והוא עשוי להיות מותאם culturing של אוכלוסיות כליות ^17. דג הזברה גנטיקה כימיים הצליחו זיהוי של מסלולים כי לווסת HSCs ואת אבות כליות בהקשרים שונים ^18-20, ותמשיך להיות שימושי כדי לבחון השדרה בשילוב עם טכניקות הביולוגיה מעל התא. יחדיו, היו מספר תרומות פורץ אל השדות להמטולוגיה נפרולוגיה באמצעות מודל דג הזברה, והמשיך מחקר בתחומים אלה מבטיח תובנות להחזיק עוד טרנספורמטיבי בשנים הקרובות.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
שם מגיב	חברה	מספר קטלוגי
Dissection מספריים	Roboz	RS-5882
Dissection מלקחיים	Roboz	RS-5010
Dissection מלקחיים זוויתי	Roboz	RS-5058
Tricaine	סיגמא	E10521
Paraformaldehyde	מיקרוסקופית אלקטרונים שירותים	19210