, טיהור הכנה, אפיון של מכלולים Lanthanide לשימוש בתור סוכנים בניגוד עבור דימות תהודה מגנטית

Summary

אנו מדגימים את metalation, טיהור, ואפיון של מתחמי lanthanide. מתחמי המתואר כאן יכול להיות מצומדת כדי מקרומולקולות כדי לאפשר מעקב של המולקולות הללו באמצעות דימות בתהודה מגנטית.

Abstract

Polyaminopolycarboxylate מבוססי ligands משמשות Chelate יונים lanthanide, ואת התסביכים הנובעים שימושיים כמו סוכנים בניגוד עבור דימות תהודה מגנטית (MRI). Ligands זמינים מסחרית רבים שימושיים במיוחד משום שהם מכילים קבוצות פונקציונליות המאפשרים מהיר טוהר גבוהה, גבוהה מניב הצמידה אל מקרומולקולות ביומולקולות באמצעות אמין-reactive אסטרים מופעל וקבוצות isothiocyanate או תיאול-reactive maleimides. בעוד metalation של ligands אלה נחשב וידוע בתחום הכימיה bioconjugation, הבדלים דקים נהלים metalation חייב להילקח בחשבון בעת ​​בחירת חומרי מתכת ההתחלה. יתר על כן, מספר רב של אפשרויות עבור טיהור קיים אפיון, ואת הבחירה של ההליך היעיל ביותר חלקית תלוי בבחירה של חומרי המוצא. הבדלים אלה הם עדין מוזנח לעתים קרובות בפרוטוקולים שפורסמו. הנה, המטרה שלנו היא להוכיח השיטות הנפוצות עבור metalation, טיהור, ואפיון של מתחמי lanthanide שיכולים לשמש כסוכני בניגוד עבור MRI (איור 1). אנו צופים כי פרסום זה יאפשר למדענים ביו לשלב התגובות complexation lanthanide לתוך רפרטואר התגובות שלהם בשימוש נפוץ על ידי הקלת הבחירה של חומרי המוצא ושיטות טיהור.

Protocol

1. Metalation באמצעות LnCl ₃ מלחי

1. ממיסים את ליגנד במים כדי לייצר פתרון 30-265 מ"מ. ליגנד 2 - (4-isothiocyanatobenzyl)-diethylenetriamine חומצה pentaacetic (p-SCN-BN-DTPA) שימש וידאו זה בריכוז של 73 mM.
2. התאם את ה-pH של התמיסה של ליגנד על בין 5.5 ו 7.0 על ידי הוספת 1 ​​M NH ₄ OH. בסרטון הזה, 0.2 מ"ל של הפתרון 1 M NH ₄ OH היה ​​בשימוש.
3. ממיסים 1-2 ושווי של LnCl ₃ במים כדי לייצר פתרון עם ריכוז של mM 5000-1000. בסרטון הזה, EuCl ₃ ו GdCl ₃ שימשו ריכוזי mM 111. עודף של מתכת משמש לעיתים קרובות לכונן metalation השלמת וכתוצאה מכך לפשט טיהור.
4. מוסיפים את הפתרון של LnCl ₃ לפתרון ליגנד תוך ערבוב.
5. לאחר תוספת של LnCl _3, להתאים את ה-pH של תערובת התגובה שהתקבל בין 5.5 לבין 7.0 ידי הוספת 0.2 M NH ₄ OH. סך של 0.5 מ"ל של פתרון 0.2 M NH ₄ OH שימש וידאו. אם ליגנד שלך מכיל חומצה רגיש קבוצות פונקציונליות, להתאים את רמת החומציות פעמים רבות במהלך שלב זה. זהירות - אם הפתרון הופך בסיסי מדי, בסיס באף אחת מהקבוצות רגיש פונקציונליים, כמו isothiocyanate, יהיה שניתנו שמיש עבור הצמידה.
6. צג התגובה באמצעות מדידות pH. התגובה היא להשלים כאשר רמת החומציות נשארת קבועה.

2. העלאת ה-pH הבדיקות (לא כלול ב וידאו זה, אבל טוב ligands ללא בסיס רגיש קבוצות פונקציונליות)

1. הוסף מרוכז NH ₄ OH לתערובת התגובה כדי להתאים את pH עד ≥ 11. צעד זה יהיה לזרז כל מתכת uncomplexed כמו הידרוקסיד מסיסים.
2. סינון supernatant דרך פילטר 0.2 מיקרומטר. אם התערובת התגובה קבקבים את המסנן, centrifuging ו decanting לפני סינון מומלץ.
3. אם דיאליזה לא יבוצעו, להסיר את הממס בלחץ מופחת (אידוי סיבובית או ייבוש להקפיא מומלץ).
4. צעדים 2.1-2.3 ניתן לחזור אם lanthanide חינם נשאר.

3. דיאליזה הבדיקות

1. חותכים את צינורות דיאליזה באורך המתאים (על פי ההנחיות של היצרן) להחזיק את נפח דגימה תוך השארת אורך נוסף (כ 10% מנפח לדוגמה). בסרטון הזה, 100-500 דלתון משקל מולקולרי חתוכים (MWCO) קרום היה בשימוש, אבל יותר צינורות MWCO יכול לשמש המתאים אם נטיה מבוצע לפני metalation. כמו כן, קלטות דיאליזה יכול לשמש כחלופה צינורות דיאליזה אם תרצה בכך.
2. אם נדרשים על פי ההנחיות של היצרן, להשרות את צינורות דיאליזה לקצץ במים למשך 15 דקות בטמפרטורת הסביבה.
3. מלאו מאגר דיאליזה (א 1 כוס L שימש וידאו) עם מים (dialysate). נפח dialysate צריך להיות כ 100x כי המדגם.
4. בסוף מקפלים אחד צינורות פעמיים ולהבטיח את החלק המקופל של צינורות עם מהדק סגר דיאליזה. עטפו את קצה הסגר בגומייה כדי לוודא שהוא נשאר סגור במהלך דיאליזה.
5. סנן את תערובת התגובה דרך פילטר 0.2 מיקרומטר, ו לטעון את תסנין אל הקצה הפתוח של הצינור נזהרים שלא לקרוע את צינורות. הקפד להשאיר מרחב הראש מספיק כדי לסגור את הצינור.
6. מקפלים את הקצה הפתוח הנותרים של צינורות כפולה, מאובטח עם סגר, ועוטפים את הסגר עם גומייה כמו בשלב 3.4.
7. צרף בקבוקון זכוכית המכיל אוויר כדי לצבוט על קצה אחד של הצינור דיאליזה באמצעות גומייה. צרף בקבוקון המכיל חול כדי לצבוט השני. צלוחיות אלה מבטיחים כי צינורות נשאר שקוע dialysate.
8. מניחים את צינורות מלאים המאגר דיאליזה המכיל dialysate.
9. מערבבים את dialysate באמצעות צלחת ומערבבים מגנטיים במהירות איטית (לא vortexing) בטמפרטורת הסביבה.
10. שינוי dialysate 3x במהלך יום (ב וידאו זה, dialysate השתנה ב 2.5, 6.5, 11.5 ו - ח), ולאחר מכן לאפשר דיאליזה להמשיך הלילה (עבור סכום כולל של 20-28 שעות של טיפול דיאליזה).
11. הסר את צינורות דיאליזה מתוך dialysate בזהירות לפתוח אחד סגר להסיר את המדגם. שטפו את צינורות דיאליזה 3x עם מים לשלב בין כביסות עם המדגם.
12. הסר את המים בלחץ מופחת. ייבוש להקפיא משמש הווידאו הזה.

4. הערכת נוכחות של מתכת חינם

1. ממיסים את מורכבות מתכת חוצץ אצטט (הכנת החיץ: ממיסים 1.4 מ"ל של חומצה אצטית במים 400 מ"ל, כדי להתאים את pH 5.8 עם 1 מ NH ₄ OH, ולהוסיף מים כדי לייצר בנפח כולל של 500 מ"ל) ומוסיפים את xylenol תפוז אינדיקטור (16 מיקרומטר במאגר pH 5.8). בסרטון הזה, 0.3 מ"ג מורכב פורק ב 0.3 מ"ל של חיץ 3 מ"ל של תמיסת אינדיקטור נוסף.
2. זיהוי נוכחות של מתכת בחינם דרך תצפית של שינוי הצבע של האינדיקטור מצהוב סגול.
3. אם תרצה, בסכום של מתכת חינם ניתן לכמת ידי יצירת עקומת כיול ^1. לחלופין, arsenazo את הצבע השלישי ניתן להשתמש במקום xylenol כתום ^2. אם המתכת נותר חופשי, המדגם צריך להיות מטוהרים נוסף באמצעות דיאליזה, טור desalting, או בעלי ביצועים גבוהים כרומטוגרפיה נוזלית (HPLC) לפני אפיון.

5. קביעת מספר מים תיאום (q)

1. הכן פתרון של האיחוד האירופי ^השלישי המכילים מורכבות (~ 1 מ"מ) H ₂ O ועוד פתרון של ריכוז זהה D ₂ O. לפני ניתוח, הפתרון D ₂ O יש התאדו ונמוגו D ₂ O שלוש פעמים כדי להסיר שאריות H ₂ O.
2. מוסיפים את פתרון מים קובט נקי, והמקום קובט לתוך spectrofluorometer.
3. לבצע סריקות עירור ופליטה כדי לקבוע את מקסימום לכל (~ 395 ~ 595 ננומטר ננומטר, בהתאמה).
4. בצעו ניסוי זרחני זמן דעיכה באמצעות הפרמטרים הבאים: עירור ואת אורכי גל הפליטה נקבע מתוך 5.3 צעד, עירור ושיסף את פליטת רוחבי (5 ננומטר), פלאש לספור (100), עיכוב ראשוני (0.01 ms), עיכוב המרבי (13 מילישניות) , ולעכב תוספת (0.1 ms). תנאים אלה מתאימים ביותר תסביכים, אבל העיכוב המקסימלי וערכים תוספת ניתן להגדיל או להקטין על פי מין עם דעיכה ארוכה מאוד או קצרה מאוד.
5. חזור על שלב 5.4 עם פתרון ₂ O D מוכן בשלב 5.1.
6. מתוך הארה, ריקבון נתונים המתקבלים ב 5.4 ו 5.5, העלילה יומן הטבעי של עוצמת לעומת הזמן. השיפוע של קווים אלה הם שיעורי ריקבון (τ ^-1) (איור 2). בסרטון הזה, Microsoft Excel 2007 היה השתמשו כדי ליצור את יומן מגרשים טבעי מן הנתונים הגולמיים. השתמש שיעורי ריקבון במשוואה שפותחה על ידי הורוקס ועמיתים לעבודה (EQ 1) ^3. אם ליגנד שלך מכיל OH או NH קבוצות מתואמת מתכת, אז המשוואה חייבת להיות שונה לפני השימוש ^3.

eq 1:

6. Relaxivity מדידות

1. בחר את המצב היישום הרצוי על הנתח הרפיה זמן: T ₁ (זמן רגיעה האורך) או T ₂ (זמן רגיעה רוחבי).
2. הכינו סדרה של דגימות המכילות ריכוזים שונים של אלוקים ^השלישי המכילים מורכבים ממס מימית. בסרטון הזה, מים שימש הממס ופתרונות של 10.0, 5.00, 2.50, 1.25, 0.625, ו - 0 mM היו מוכנים. ממיסים מימית או מאגרים אחרים יכול לשמש, אולם חשוב להשתמש ממס כמו ריק. היקף הסופי של המדגם היא ספציפית המכשיר אשר נמצא בשימוש.
3. מקום מדגם במכשיר ולתת לו לשבת במשך 5 דקות כדי לאזן את הטמפרטורה של המכשיר (37 מעלות צלזיוס בסרטון הזה).
4. קבע את זמן הרפיה (ביחידות של s) על ידי התאמת הפרמטרים של התוכנה כדי לקבל עקומה מעריכית חלקה עבור T ₁ או T ₂ (עקומות נציג עבור T ₁ ו-T ₂ מוצגים איור 3).
5. חזור על שלבים 6.3 ו - 6.4 עבור כל דגימות כולל ריק.
6. חשב את ההפוכה של T נמדד ₁ או T ₂ ערכים ביחידות של s ^-1.
7. מגרש ₁ ^-1 T או T ₂ ^-1 ערכים לעומת ריכוז ה ^III (ביחידות של mM). בגלל האופי hygroscopic ^ה-III המכילות קומפלקסים, לאשר את ריכוז ה ^III באמצעות לספקטרופוטומטריה קליטה אטומי או מצמידים אינדוקטיבי ספקטרומטריית פלזמה המונית. התאם את העלילה עם קו ישר. העלילה נציג מוצג באיור 4.
8. השיפוע של הקו הוא מצויד relaxivity (r ₁ או r ₂ עבור T ₁ ו-T _2, בהתאמה) יש יחידות של mM ^-1 s ^-1.

7. נציג תוצאות

נציג נתונים עבור השלבים פרוטוקול זה נכללו טבלאות סעיף דמויות. בנוסף למספר מים התיאום ואפיון relaxivity המתואר בפרוטוקול, חשוב לאפיין את המוצרים הסופיים תוך שימוש בטכניקות כימי סטנדרטי. זהותו של המתחם ניתן להשיג באמצעות ספקטרומטריית מסה, ואת ספקטרום המונית נציג מראה את דפוסי איזוטופ אבחון ה ^III - והאיחוד האירופי ^השלישי המכילים קומפלקסים מוצגים באיור 5. יתר על כן, עבור מי שאינם ה ^III

איור 1 תוכנית כלליות metalation וטיהור:. Scheme המתאר את הליך כללית metalation ואת הסיבות לבחירת דרכי טיהור שונות.

איור 2 הארה בעוצמה העלילה:. העלילה נציג יומן הטבעי של עוצמת לעומת זמן של סעיף 5. המדרונות של קווי שנוצר עקומות דומות שנרכשו עבור המים ו-D ₂ O פתרונות משמשים עם eq 1 לאפיין את מספר מים התיאום של האיחוד האירופי ^השלישי המכילים קומפלקסים.

איור 3 ריקבון הרפיה זמן עקומות:. נציג נתונים עבור (משמאל) ו - T ₁ (מימין) T ₂ הרכישה. סטיות אלה צורות עקומת תייצר נתונים לא אמינים.

איור 4 נחישות Relaxivity:. העלילה נציג של 1 / T ₁ לעומת ריכוז ^ה-III. השיפוע של הקו הוא מצויד relaxivity ובעל יחידות של mM ^-1 s ^-1.

איור 5 ספקטרה המוניים:. מסה נציג ספקטרום מראה את דפוסי איזוטופ אבחון (משמאל) ^ה-III המכיל תסביכים (מימין) האיחוד האירופי ^השלישי המכילים קומפלקסים. פסגות שחור גאוס לייצג את ההפצה איזוטופ תיאורטיים הקווים האדומים הם הנתונים בפועל.

Discussion

בהתחשב במספר הולך וגדל של פרסומים הכוללים lanthanide מבוססי סוכנים בניגוד ^4-14, חשוב כי הטיפול נלקח בהכנת, טיהור, ואפיון מוצרים כדי להבטיח תוצאות לשעתקו דומה. קומפלקסים אלה נחשבים לעתים קרובות מאתגרת לטהר ולאפיין יחסית מולקולות אורגניות בשל אופי פאראמגנטיים שלהם את הרגישות של כל קבוצות פונקציונליות שניתן להשתמש בו עבור bioconjugation. תיארנו שיטות מקובלות לסינתזה, טיהור, ואפיון של מתחמי lanthanide. עם זאת, כאשר בוחרים באחת השיטות הבאות חשוב לבחון את מערכת ספציפית הנלמד....

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
ריאגנטים וציוד	חברה	מספר קטלוגי
EuCl 3 • 6 שעות 2 O	סיגמא אולדריץ	203254-5G
p-SCN-BN-DTPA	Macrocyclics	B-305
אמוניום הידרוקסיד	EMD	AX1303-3
ספקטרה / por ביוטק תאית אסתר (CE) ממברנה דיאליזה - 500 D MWCO	פישר סיינטיפיק	68-671-24
Millipore Millex IC-LG סנן יחידות	פישר סיינטיפיק	SLLG C13 NL
xylenol כתום tetrasodium מלח	אלפא Aesar	41379
חומצה אצטית	Fluka	49199
D 2 O	קיימברידג' איזוטופ Laboratories, Inc	DLM-4-25
מטהר מים	ELGA	Purelab Ultra
ביצועים גבוהים נוזלי כרומטוגרפיה ו ספקטרומטריית מסה	Shimadzu	LCMS-2010EV
זמן רגיעה מנתח	Bruker	mq60 minispec
UV-VIS ספקטרופוטומטר	פישר סיינטיפיק	20-624-00092
להקפיא מייבש	פישר סיינטיפיק	10-030-133
ה-pH מטר	חנה מכשירים	HI 221
spectrofluorometer	HORIBA Jobin Yvon	FluoroMax-4
מולקולרית משקל מחשבון גרסה 6.46 על ידי מתיו מונרו, להוריד 17 אוקטובר 2009	http://ncrr.pnl.gov/software/	מולקולרית משקל מחשבון