השיטה מתוארת למדוד סמנים ביוכימיים של הילוד היפוקסיה, איסכמיה. הגישה מנצל גבוהה כרומטוגרפיה נוזלית בלחץ (HPLC) וגז כרומטוגרפיה ספקטרומטריית מסה (GC / MS).
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
במאמר זה
סיכום
תקציר
איסכמיה היפוקסיה ילודים מאופיינת זלוף דם לקויה של רקמה או חוסר מערכתית של חמצן. מצב זה הוא חשב לגרום / להחמיר הפרעות בילוד מתועדת היטב כולל ליקוי נוירולוגי 1-3. ירידה בייצור אדנוזין טריפוספט מתרחשת עקב חוסר זרחון חמצוני. כדי לפצות על האנרגיה הזו מולקולות מקופח במדינה המכיל פוספט גבוה באג"ח אנרגיה 2 מושפל. זה מוביל רמות גבוהות של אדנוזין שהוא מושפל לאחר מכן inosine, hypoxanthine, xanthine, ולבסוף חומצת השתן. הסופי שני שלבים בתהליך זה השפלה מבוצעות על ידי oxidoreductase xanthine. אנזים זה קיים בצורה של דהידרוגנז xanthine בתנאים normoxic אבל מומר מונואמין xanthine (XO) תחת היפוקסיה-reperfusion בנסיבות 4, 5. בניגוד דהידרוגנז xanthine, XO מייצר חמצן כתוצר לוואי של purine השפלה 4, 6. זה מי חמצן בשילוב עם אחרים מינים חמצן מגיב (ROS) המיוצר במהלך היפוקסיה, oxidizes חומצת שתן כדי ליצור allantoin ומגיב עם ממברנות שומנים בדם ליצירת malondialdehyde (מד"א) 7-9. רוב היונקים, בני האדם פטור, להחזיק את uricase האנזים, אשר ממיר חומצת שתן כדי allantoin. אצל בני אדם, לעומת זאת, allantoin יכול להיות רק נוצרו על ידי חמצון ROS בתיווך של חומצת השתן. בגלל זה, allantoin נחשב סמן של עקה חמצונית בבני אדם, אך לא יונקים כי יש uricase.
אנו מתארים שיטות העסקת גבוהה כרומטוגרפיה נוזלית בלחץ (HPLC) גז כרומטוגרפיה ספקטרומטריית מסה (GCMS) כדי למדוד סמנים ביוכימיים של איסכמיה היפוקסיה הילוד. דם האדם משמש עבור רוב הבדיקות. דם בעלי חיים עשוי לשמש גם תוך הכרה פוטנציאל allantoin uricase שנוצר. מטבוליטים purine היו קשורים היפוקסיה מוקדם ככל 1963 ואמינות hypoxanthine, xanthine, וחומצת השתן כאינדיקטורים ביוכימיים של היפוקסיה בילוד היה תוקף על ידי מספר חוקרים 10-13. שיטת HPLC משמש וכימות של תרכובות purine הוא מהיר, אמין לשחזור. השיטה GC / MS המשמש כימות של allantoin, סמן חדש יחסית של סטרס חמצוני, הותאם מ גרובר ואח' 7. שיטה זו מונעת חפצים מסוימים דורש כמויות נמוכות של המדגם. שיטות המשמשות לסינתזה של MMDA תוארו במקום אחר 14, 15. GC / MS כימות מבוסס מד"א הותאם מ Paroni et al. ו Cighetti et al. 16, 17. פעילות מונואמין Xanthine נמדדה על ידי HPLC ידי לכימות ההמרה של pterin כדי isoxanthopterin 18. גישה זו הוכיחה להיות רגיש מספיק לשחזור.
פרוטוקול
1. לדוגמה איסוף ועיבוד
- איסוף דגימת דם בתוך צינור K3E 6ml K3 EDTA אשר נשמר על הקרח.
- בתוך דקות 2 של אוסף, צנטריפוגות מדגם ב 4 ° C ב ז 1500 עבור 10 דקות.
- מעבירים את supernatant (פלזמה) אל צינור microcentrifuge 1.5ml.
- צנטריפוגה ב 4 ° C ב g 18,000 למשך 30 דקות.
- הסר את aliquots supernatant ולהעביר אותם לתוך צינורות microcentrifuge נפרד purine (200μ....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
השיטות שתוארו כאן היתר הערכה של איסכמיה היפוקסיה הילוד. פרוטוקול זה משלב מדידות של סמנים של קיפוח (ATP) באנרגיה, סטרס חמצוני, נזק חמצוני, ופעילות האנזים לקבל תמונה ביוכימיים הכוללת של נוכחות או אפילו את מידת איסכמיה hypoxic. למרות התועלת של שיטה זו, קיימות מגבלות פוטנציאליים. ראשית, זה לוקח בערך 1-2 מ"ל של דם כדי לאסוף פלזמה מספיק כדי להפעיל את כל מבחני. זו לא תהיה בעיה של מבוגרים או ילדים, אבל זה הופך להיות עניין בעבודה עם תינוקות, במיוחד אלה מוקדמת. אנו לעקוף בעיה זו על ידי.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
אין ניגודי אינטרסים הכריז.
תודות
עבודה זו ממומנת על ידי המכונים הלאומיים לבריאות NR011209 R01-03
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| שם מגיב | חברה | מספר קטלוגי | הערות (אופציונלי) |
| 6ml K3E EDTA צינור K3 | פישר סיינטיפיק | 2204061 | |
| 5702R צנטריפוגות | פישר סיינטיפיק | 05413319 | עם 13 & מתאם 16mm |
| Microcentrifuge 1.5ml צינור | ארה"ב מדעי | 1615-5599 | |
| 2-Aminopurine | סיגמא אולדריץ | A3509 | |
| וריאן קארי 100 ספקטרופוטומטר | Agilant טכנולוגיות | 0010071500 | |
| מלומד SpeedVac | Thermo Scientific | SC210A-115 | |
| מיקרון המכשיר מסנן צנטריפוגלי | פישר סיינטיפיק | UFC501596 | |
| Supelcosil LC-18-S טור | סיגמא אולדריץ | 58931 | |
| Supelcosil LC-18-S Supelguard מחסנית ומחזיק | סיגמא אולדריץ | 59629 | |
| HPLC | ווטרס | ||
| GCMS Vial | פישר סיינטיפיק | 03376607 | |
| DL-Allantoin-5 -13 C; -15 1 N | CDN איזוטופים | M-2307 | לוט # L340P9 |
| MTBSTFA | Thermo Scientific | 48920 | |
| פירידין | סיגמא אולדריץ | 270970 | |
| 5973E GC / MSD | Agilent Technologies | G7021A | חלק # עבור 5975E GC / MS |
| 3-Ethoxymethacrolein | סיגמא אולדריץ | 232548 | |
| סודיום הידרוקסיד | סיגמא אולדריץ | S5881 | |
| Dichloromethane | סיגמא אולדריץ | 270997 | |
| בנזין | סיגמא אולדריץ | 401765 | |
| Diisopropyl האתר | סיגמא אולדריץ | 38270 | |
| BHT | סיגמא אולדריץ | B1378 | |
| אתנול | סיגמא אולדריץ | 459844 | |
| Phenylhydrazine | סיגמא אולדריץ | P26252 |
מקורות
- Harkness, R. A., Whitelaw, A. G., Simmonds, R. J. Intrapartum hypoxia: the association between neurological assessment of damage and abnormal excretion of ATP metabolites. J Clin Pathol. 35, 999-1007 (1982).
- Shalak, L., Perlman, J. M.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
