Lentivirus בתיווך ויזואליזציה מניפולציה גנטית של עצב סנסורי חוש הריח In vivo</em

סיכום

אנו מציגים טכניקה lentiviral מניפולציה גנטית להדמיה של האקסון נוירון יחיד חושי הריח arborization מסוף שלה In vivo.

תקציר

פיתוח מעגל חוש הריח המדויק מסתמך על תחזית מדויקת של חושי הריח נוירון (OSN) אקסונים מטרות הסינפטי שלהם הנורה חוש הריח (OB). מנגנונים מולקולריים של צמיחה האקסון OSN ומיקוד אינם מובנים היטב. ביטוי גנים מניפולציה ובעקבות חזותי של אקסונים OSN יחיד מסוף סוכת המורפולוגיה שלהם עד כה מאתגר. כדי לחקור תפקוד גנים ברמת תא בודד בתוך מסגרת הזמן המצוין, פיתחנו טכניקה המבוססת lentiviral לתפעל ביטוי גנים OSNs in vivo. חלקיקים lentiviral מועברות על ידי OSNs microinjection לתוך אפיתל ההרחה (OE). קלטות הביטוי אז הם משולבים באופן קבוע לתוך הגנום של OSNs transduced. חלבון הפלואורסצנט הירוק ביטוי מזהה OSNs נגוע מתאר מורפולוגיה כולו שלהם, כולל מסוף האקסון ארבור. בשל זמן אספקה ​​קצר בין microinjection זיהוי כתב, תפקוד לימודי הגן יכול להיות ממוקד בתוך פרק זמן צר מאוד של פיתוח. באמצעות שיטה זו, יש לנו לזהות ביטוי של GFP בתוך כמה כמו שלושה ימים עוד שלושה חודשים לאחר ההזרקה. השגנו גם יתר ביטוי shRNA בתיווך עקום על ידי microinjection lentiviral. שיטה זו מספקת מורפולוגיות מפורט של גופים OSN התא אקסונים ברמת תא בודד in vivo, ובכך מאפשר אפיון של פונקציה מועמד גנים במהלך התפתחות חוש הריח.

פרוטוקול

1. הכנה

הליך זה biosafety ברמה 2, לכן כל ההכנות הבאים עשויים במנדף Biohazard שבו נוהל microinjection מבוצע.

1. הכן מחממים 37 ° C מיטת מים: מילוי שקית אחסון מפלסטיק עם מים - חותם ולהגדיר על חימום רוקנה לחסום חממה. זה יאפשר עכברים להתאושש הזרקת הבאים.
2. מילוי מיכל פסולת Biohazard עם אקונומיקה 10% בנפח מתאים לטבילה של פסולת מתוך כל התהליך הזה.
3. הכינו צלחת לפתוח קטנה של אתנול 70% ו צלחת שנייה עם ddH2O מעוקרים מקום בארון בטיחות ביולוגית.
4. לעקר מזרק קיבולת 5μL המילטון עם מחט 33-מד ידי ריסוס מטה את הגוף ואת המחט עם 70% אתנול עם הבוכנה שלף כל הדרך. שוב ושוב לשאוב אתנול מן הצלחת להוציא אותו ואת כל הדרך לפחות 5 פעמים.
5. יש לשטוף את המחסנית על ידי מזרק מים סטריליים aspirating ולהוציא לפחות 5 פעמים. המקום מזרק בבטחה בצד בשכונה תרבות ולאפשר לו להתייבש.
6. הסר מניות ויראלי מ -80 ° C אחסון במקפיא ומניחים על קרח על מנת לאפשר הפשרה. Microinjection דורש 2μL המניות וירוס לכל העכבר titre של 10 יחידות מדבק ⁹ / mL. Lentiviruses ניתן להשיג ממקורות מסחריים או המיוצרים במעבדה לפי הפרוטוקול הוקמה (לויס et al., 2002).
7. היכונו לשלב הזרקת המספק שטח מוגבה מעל פני השטח את מכסה המנוע - יכול להשתמש תרבות 10 ס"מ צלחת מכוסה בסדין של Kimwipe.
8. סדר מגבונים אלכוהול ליד תחנת ההזרקה.

2. Microinjection של חלקיקים לתוך lentiviral אפיתל ההרחה

הנהלים כל חיה שבוצעה בשיטה זו נעשים בהתאם להנחיות שאושרו IACUC. המתח מ.א.ס. מאסכאלאס C57BL/6J המודל בעלי חיים המשמשים כל הניסויים הדגימו כאן.

1. לטשטש את הגורים העכבר על ידי היפותרמיה ידי לקיחת עכבר גור (P0-P3) מתוך הכלוב לשים את הגור על כפפה חתך פתוח על הקרח במשך 5 דקות.
2. בזמן ההמתנה הגור להיות בהרדמה מלאה, 2μL לשאוב מניות נגיפי לתוך המזרק המילטון מעוקרים.
3. מניחים את העכבר על גבי הגור בשלב ההזרקה. משוך בעדינות עור מן החלק העליון של הראש ליד האוזן לכיוון החלק העליון של הצוואר. זה אמור לספק משטח העור לימד על חלל האף וגם יקל ההזרקה.
4. הכנס את המחט דרך החלק העליון של חלל האף על 3mm מתחת לפני השטח של העור כדי להגיע אפיתל ההרחה. Microinject 0.5μL של פתרון וירוס לכל זריקה, בוחרים בשני אתרים לכל צד, הן על ימין ועל שמאל (ארבע זריקות בסך הכל לכל עכבר = 2μL של הנגיף הצורך). אתרי הזרקה יש כשל בנפרד אחד מהשני. עבור המיקוד של אתרי הזרקה נכונה, החיפוש פני הגולגולת הגב על קווי המתאר של הנורה חוש הריח. קו זה גלוי בקושי בלידה דרך העור שקופה למחצה לבין הגולגולת. כדי להפוך את שתי זריקות לכל צד, מטרת זריקה אחת מקורי רק להתוות נורה אחת על ציר המדיאלי. הפוך את הכניסה second לרוחב להתוות את הנורה, אך הקפד זווית זריקה מדיאלית, כך שאתה יכול להגיע אפיתל הריח שנמצא מתחת ventrally הנורה. הימנע חודר את הנורה חוש הריח!
5. כתם יבש כל פתרון וירוס שיורית או דם עלול להימלט מן הזריקה או פתחי הנחיריים באמצעות Kimwipe. מיד להיפטר Kimwipes את מיכל נוזל אקונומיקה מדוללת Biohazard.
6. מניחים את העכבר מוזרק על מיטת מים בחממה.
7. חזור על שלבים 1-4 עבור כל העכברים להיות מוזרק, נזכר תצטרך 2μL על מניות וירוס לכל עכבר.
8. בואו עכברים להתאושש על החממה מיטת מים במשך 30 דקות לפני החזרה להם כלוב קינון המקורי שלהם.
9. השלך את הבמה microinjection, מגבונים sanitizing ואת כל נייר מוצרים נוספים ניקוי לרשות נוזל אקונומיקה Biohazard.
10. נקה את המזרק המילטון על ידי שאיפה חוזרות פליטה של ​​אתנול ואז מים כפי שנעשה בשלבים הכנה. אפשר המזרק לייבוש.
11. לקבלת יעילות מקסימלית התמרה לחזור על הליך זה שוב 4 שעות. OSNs נגועים ניתן דמיינו בכל אורך של התא כמה כמו שלושה ימים.

3. אימונוהיסטוכימיה של צף סעיפים הנורה חוש הריח

1. הקורבן עכבר מוזרק בנקודת הזמן הרצוי זלוף לתקן את הרקמה עם paraformaldehyde 4%. לנתח את OB. מדגירים את paraformaldehyde הלילה ואז סוכרוז 30% PBS לילה. שבץ בינוני הטבעה אוקטובר על קרח יבש.
2. העטרה סעיפים OB מתקבלים על 60μm עובי באמצעות cryostat. טאטא סעיפים הנורה לתוך צלחת 10 ס"מ תרבות עם 5 מ"ל 1x PBS (pH 7.4). מדורים צריכים להיות כל הזמן צף PBS לאפשר אוקטובר עד דissolve. העברת חלקים צפים PBS לתוך בקבוקון 50 מ"ל קונית.
3. אפשר להסתפק בסעיפים לחלק התחתון של המכל. אבק את PBS בלי להתחנף כל הסעיפים. לשטוף חלקים עם רקמה PBS 20mL. חזור ליישב צעדים אבק. רקמה Resuspend עם 10 מ"ל PBS וחתכים העברת צף חרוטי בקבוקון 15 מ"ל עבור immunostaining. לאחר סעיפים רקמות התיישבו, האבק PBS supernatant מבלי להפריע רקמות. סעיפים Resuspend עם 0.3% טריטון X-100 ב 1x PBS, pH 7.4 (PBS-Tx) המאפשר ניקוי כדי לנקב קרום התא. דגירה במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר. אבק את supernatant ו הדגירה לחזור עם PBS-Tx פעמיים.
4. דגירה סעיפים רקמות 10 מ"ל של תמיסת חסימה (נסיוב סוס 5% PBS-Tx) למשך שעתיים בטמפרטורת החדר.
5. לשטוף פתרון חסימת לפחות פעמיים עם PBS-Tx במשך 15 דקות כל בטמפרטורת החדר.
6. הכן 2ml של פתרון הנוגדן העיקרי PBS-TX. ראה ריאגנטים בסעיף ציוד נוגדנים השתמשו בניסוי הזה.
7. החלף לשטוף second PBS-Tx חסימת פתרון נוגדן ראשוני. לדגור על פלטפורמה מתנדנדת לאט (~ 30rpm) בשעה 4 מעלות צלזיוס במשך 24-48 שעות כדי להבטיח חדירה מעמיקה לתוך בסעיפים צף 60μm.
8. לאחר דגירה, הפתרון נוגדן ראשוני ניתן לאחזר בזהירות בעזרת פיפטה ומאוחסן על 4 מעלות צלזיוס עד לשימוש חוזר עוד פעמיים בתוך שבועיים ללא אובדן משמעותי של עוצמת מכתים.
9. לשטוף חלקים שלוש פעמים PBS-Tx במשך 20 דקות כל בטמפרטורת החדר עם סיבוב עדין (~ 30rpm).
10. הכן 2ml של דילול נוגדנים משני PBS-TX. אבק מעל לשטוף האחרון ולהוסיף פתרון נוגדנים משני סעיפים רקמות. לעטוף את החלק החיצוני של הבקבוקון מכתים בנייר אלומיניום כדי לחסום את האור, אשר יכול לגרום photobleaching fluorophore. המקום עטוף הבקבוקון על פלטפורמה לאט הנדנדה דגירה על 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה.
11. בטל פתרון נוגדנים משני על ידי שאיבת אבק משם. לשטוף חלקים פעם עם PBS-Tx במשך 20 דקות כל בטמפרטורת החדר. לשטוף פעמיים נוספות עם PBS (pH 7.4) במשך 20 דקות כל בטמפרטורת החדר. הר בסעיפים רקמה צבעונית על גבי שקופיות הזכוכית באמצעות Fluoromount G.
12. מסך באמצעות סעיפים מוכתם עבור אקסונים OSN נגוע חיובי טרמיני האקסון באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי.
13. כדי לבנות תצוגה תלת מימדי של התווית OSN האקסון ואת מסוף ארבור, ליצור סדרה של קטעים אופטי דרך עומק 60μm של הפרוסה היעד רקמות OB (לאורך ציר z) באמצעות מיקרוסקופ confocal.
14. מחסנית זו של Z-סעיף תמונות יכול להיות מוקרן יחד לאחר מכן לשחזר פרספקטיבה 360 מעלות של סיבוב אחד שכותרתו OSN האקסון, כולל פירוט סוכת מסוף בשלמותה. זווית סיבוב אחד כל אחד יכול ליפול בפח ו מיוצא כקובץ תמונה (כלומר, JPG, TIFF) עבור מצגת בפורמט 2D.

4. נציג תוצאות

בעזרת השיטות שתוארו כאן, אנו יכולים transduce עצב סנסורי על ידי חוש הריח lentivirus in vivo. יש לנו אפוא OSNs נגוע דמיינו רחוק עם GFP וכתבים mCherry ניאון, כמו גם עם חלבון myc-tagged היתוך דרך immunocytochemistry. טכניקה זו מספקת שפע של OSNs נגועים. ובכל זאת, התמרה מתרחשת לסירוגין מספיק כדי לספק OSNs שכותרתו בנפרד, ובכך מאפשר לניתוח מורפולוגיה תא בודד. אקסונים מסופי האקסון הם צילמו בתוך קטעי רקמה OB בתוך סביבה מולדתם על ידי מיקרוסקופיה confocal (איור 1). כל OSN האקסון מסוף סוכת יכול בדרך כלל להיות שבוי בתוך סעיף 40-50μm אופטי. הגדלה גבוהה של נגוע מסופי האקסון OSN מאפשר ניתוח מפורט של מורפולוגיה סוכת axonal בשכבת גלומרולרי.

באיור 1. מסלולו של נוירון יחיד חושי הריח האקסון ואת מסוף סוכת שלה.) קטע העטרה של הנורה חוש הריח של העכבר P7 מראה את שכבת עצב ההרחה (ONL) immunostained עבור OMP (אדום) ואת השכבה גלומרולרי (GL) immunostained עם שני OMP ו Vglut2 (אפור). האקסון יחיד הריח נוירון חושי להביע GFP (ירוק) עובר בתוך ONL וחודר לתוך המבנה גלומרולרי. ב) מסוף האקסון מורפולוגיה סוכת בתוך glomerulus המסומן בבירור על ידי ביטוי של GFP. Vglut2 שיתוף מכתים באפור מאירה את אזור glomular הכולל שבתוכו ה-GFP חיובי האקסון מרחיב abor סופנית. ג) OSNs נגוע lentiviral להביע GFP (ירוק) ב OE. Cytostructure של אפיתל הריח מוצג עם מכתים DAPI (כחול). ביטוי של GFP מאפשר הדמיה של גופים OSN התא תהליכים תאיים שלהם OE. ד) האקסון OSN ומורפולוגיה מסוף עם הביטוי Rap1GAP2 עקום על ידי shRNA. Lentiviruses נושא קלטת ביטוי כפול עם Rap1GAP2 shRNA תחת מקדם את העכבר U6 ו-GFP תחתהאמרגן CMV יושמו OE. אינפקטד מסופי האקסון הריח הציג מסוף סוכת פשוטה יותר בהשוואה לזו של פקד ה-GFP בלבד. בר = 20μm.

דיון

Microinjection תוצאות lentivirus בהעברת קבע בונה גנים לתוך הדנ"א הגנומי OSN. גישה זו מאפשרת לנו לבצע מניפולציות לטווח קצר או לטווח ארוך של גנים מועמדים באמצעות overexpression או בתיווך shRNA עקום למטה. בנוסף, אנו יכולים fluorescently תווית OSNs יחיד בקו הקיים עכבר מהונדס לקיים שיתוף לוקליזציה של אוכלוסיות קולטן odorant. Microinjection נדרשת התמרה lentiviral של OSNs. יש לנו ניסיון הסמקה ההשעיה lentivirus לתוך חלל האף אל transduce OSNs ללא הצלחה. לפיכך, אנו מבצעים microinjectio...

חומרים