מיקוד Bulb נוירונים חוש הריח שימוש משולב In vivo Electroporation ו Gal4 מבוסס Enhancer מלכודת קווי דג הזברה

סיכום

ברזולוציה של זמן ומרחב של מניפולציות גנטיות קובע את הספקטרום של תופעות ביולוגיות כי הם יכולים להפריע. כאן אנו משתמשים ובזמן מרחבית בדידה In vivo, בשילוב עם קווי מהונדס של דג הזברה, כדי לגרום ביטוי של GFP transgene במיוחד בנוירונים של הנורה חוש הריח מתפתח.

תקציר

בשנת vivo electroporation היא שיטה רבת עוצמה להעברת ביטוי ה-DNA פלסמידים, RNAi ריאגנטים, ו morpholino אנטי תחושה oligonucleotides לאזורים ספציפיים של עוברים בפיתוח, כולל אלה של ג elegans, אפרוח, Xenopus, דג הזברה, ועכבר ^1. בשנת דג הזברה, ב electroporation vivo הוכח יש רזולוציה במרחב ובזמן מצוין עבור משלוח של אלה ריאגנטים ^2-7. הפתרון הזמני של שיטה זו הוא חשוב משום שהוא מאפשר שילוב של חומרים כימיים אלה בשלבים מסוימים בהתפתחות. יתר על כן, כי הביטוי של וקטורים electroporated מתרחשת בתוך 6 שעות ^7, שיטה זו היא יותר מאשר בזמן גישות מהונדס. בעוד ברזולוציה מרחבית יכול להיות מדויק מאוד, כאשר המיקוד תא בודד ^{2, 6,} היא לעתים קרובות עדיף לשלב חומרים כימיים לתוך אוכלוסיה תאים ספציפיים בתוך הרקמה או מבנה. כאשר המיקוד תאים מרובים, electroporation vivo יעילה עבור משלוח לאזור ספציפי של העובר, אך במיוחד בתוך מערכת העצבים המתפתח, קשה למקד סוגי תאים מסוימים אך ורק דרך electroporation בדידה מרחבית. לחלופין, משפר מלכודת קווי מהונדס להציע תא מצוין סוג ספציפי ביטוי transgenes ^8. כאן אנו מתארים גישה המשלבת מהונדס Gal4 מבוססי קווי משפר מלכודת ⁸ עם בדידים מרחבית in vivo electroporation ^{7, 9} עד שמתמקדים בפיתוח נוירונים של הנורה הריח דג הזברה. Et (zic4: Gal4TA4, כטב"מ: mCherry) ^hzm5 (לשעבר GA80_9) קו משפר מלכודת בעבר תיאר ^8, מציגה ביטוי מהונדס ממוקד של בתיווך mCherry על ידי דג הזברה אופטימיזציה Gal4 (KalTA4) activator תעתיק באזורים שונים של המוח המתפתח כולל למוח האחורי, המוח הקטן, המוח הקדמי, ואת פקעת ההרחה. כדי למקד את ביטוי ה-GFP במיוחד כדי הנורה חוש הריח, פלסמיד עם רצף הקידוד של ה-GFP תחת שליטה של ​​Gal4 אתרים מרובים מחייב (כטב"מ) היה electroporated אל הקצה הקדמי של המוח הקדמי בשעות 24-28 לאחר ההפריה (hpf). אמנם שיטה זו משלבת פלסמיד דנ"א לאזורים שונים של המוח הקדמי, ביטוי של GFP הוא המושרה רק בתאים transgenically המבטא את KalTA4 גורם שעתוק. כך, באמצעות קו GA080_9 מהונדס, גישה זו הובילה ביטוי של GFP אך ורק הנורה חוש הריח מתפתח. תאים GFP להביע ממוקד באמצעות גישה זו הראתה תחזיות axonal טיפוסי, כפי שתואר לעיל עבור תאים מיטרלי של הנורה חוש הריח ^10. שיטה זו יכולה לשמש גם עבור משלוח ממוקד של חומרים כימיים אחרים, כולל סיכת קצר הביטוי פלסמידים התערבות RNA, אשר יספק שיטה מרחבית בדידה temporally הפסד של פונקציה ניתוח.

פרוטוקול

1. טראנסגנטי עוברים

1. כאן אנו משתמשים בקו מהונדס של דג הזברה נוצר באמצעות שיטה משפר transposon בתיווך מלכודת ^8. הכנס מהונדס כולל שני רצפים קידוד: KalTA4, גרסה דג הזברה ממוטבת של Gal4 activator תעתיק, ואת חלבון פלואורסצנטי אדום, mCherry. שיטת מלכודת משפר התשואות שורות של דג הזברה מהונדס המבטאים זה קלטת מהונדס תחת שליטה של ​​רצף משפר אנדוגני. לפיכך, בהתאם לזהותו של רצף מסוים משפר, ביטוי הן KalTA4 ו mCherry הוא מקומי על אזורים מסוימים במוח המתפתח. עבור Et (zic4: Gal4TA4, כטב"מ: mCherry) קו ^hzm5 כי אנו משתמשים כאן, הביטוי הוא מקומי לאתרים מספר למוח האחורי, המוח הקדמי, וכן, חשיבות מיוחדת כאן, את הנורה חוש הריח ⁸ (ראה גם איור 1). . בהינתן הדפוס הזה של הביטוי, ועל לוקליזציה של הקלטת בתוך הגנום, transgenes הם חזו להיות תחת שליטה של האמרגן zic4 ⁸ (ראה גם http://www.helmholtz-muenchen.de/en/idg/groups/ הדמייה / lines_distel / העיקרי .).
2. למבוגרים Et (zic4: Gal4TA4, כטב"מ: mCherry) ^hzm5 דגים הטרוזיגוטיים להכניס את מהונדס הם מזדווגים בדרך כלל עם דג (AB) WT, מובילה לצאצאים מהונדס כ 50%. (לקבלת אחוז גבוה יותר של צאצאים מהונדס, שני heterozygotes ניתן הזדווגו).
3. על מנת לחסום את היווצרות פיגמנט ולאפשר דימות פלואורסצנטי, עוברים לטיפול מהונדס עם תחילת N-100 phenylthiourea (PTU) מיקרומטר ב hpf 6-8.

2. הרכבה עוברים

1. בשלב hpf 24-28, העברת עוברים למים ביצה ללא PTU. זיהוי עוברים מהונדס ידי ביטוי mCherry באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי. הסר את קרום כוריוני מעוברים מהונדס באמצעות מלקחיים בסדר. עוברי העברה משוחררים סיסית שלהם כדי בצלחת פטרי המכילה מאגר electroporation פלוס 0.02% tricaine [הצפת electroporation: 180 mM NaCl, KCl 5 מ"מ, 1.8 מ"מ CaCl _2, 5 HEPES מ"מ, pH 7.2] ^4. אפשר 2 דקות ההרדמה ייכנסו לתוקף לפני שתמשיך לשלב גובר.
2. הכן פתרון 0.5% נמוך ההיתוך נקודות agarose ב electroporation חיץ פלוס tricaine ידי במיקרוגל את הפתרון, ואז למקם את הפתרון לתוך 34-37 ° C חממה. לאחר טמפרטורה של הפתרון agarose יש equilibrated, מקום טיפה גדול (~ 500 μl) של הפתרון agarose למרכז בצלחת פטרי 60 מ"מ. הוספת 6-8 עוברים בהרדמה לירידה זו agarose.
3. בעזרת מלקחיים קנס (או מסתיים קנס של טיפים pipet לחתוך microloader), מקם את העוברים כזה שהם כולם פונים לאותו כיוון ו מיושרים בשורה אנכית. כדי לחזק את agarose, ואת המלכודת עוברים במצב, במקום מנה על צלחת פטרי גדולה עם 2-3 מ"מ של קרח.
4. לאחר agarose יש הקרושה, להציף את המנה עם electroporation חיץ פלוס tricaine, להבטיח כי הפתרון מכסה לחלוטין את הירידה הקרושה agarose.

3. מיקרו הזרקה של ביטוי ה-DNA פלסמיד

1. הכן את ביטוי ה-GFP פלסמיד באמצעות ערכת midi או maxi-הכנה בידוד פלסמיד (למשל Qiagen). להשעות את הפלסמיד לריכוז סופי של 0.5 מיקרוגרם / μl במים סטריליים פנול אדום בתוספת 0.03%. במשך הניסוי נורה הריח מיקוד המתואר כאן, אנו משתמשים בביטוי פלסמיד עם רצף של קידוד EGFP בשליטת Gal4 אתרים מרובים מחייב (14 רצפי טנדם כטב"מ ואת האמרגן דגים הבזליים, E1b). שימוש פלסמיד, תאים בלבד transgenically המבטא את גורם שעתוק KalTA4 יוכלו להביע את ה-GFP, ולכן המתווך ביטוי ממוקד של ה-GFP.
   הערה: כאן אנו משתמשים פנול אדום עבור להדמיה של זריקות ה-DNA, שאמור להיות רלוונטי עבור מיקוד באזורים אחרים של המוח המתפתח, כל עוד האזור ניתן לגשת החדרים. עבור המיקוד של סוגי תאים אחרים שדורשים להדמיה ניאון, Bodipy או Quantam צבעים דוט העלול לשמש כדי לחזות זריקות תחת תאורה ניאון.
2. Pipettes Microinjection יכול להיות מפוברק או באמצעות חולץ פיפטה אופקי או אנכי. הגדרות חום למשוך כוח ישתנו בהתאם לסוג חולץ, סוג גוף החימום, ואת סוג של צינורות זכוכית נימי.
   בעזרת חולץ P-30 סאטר אנכי, להשתמש בהגדרה חום של 980 ו למשוך כוח של 960 לייצר ארוך, קוני, טפטפות החד זכוכית דק דופן נימי בורוסיליקט עם חוטים [כלי סאטר # BF100-78-10]. Pipettes Microinjetion משך עם הגדרות אלה אטום יש לשבור חזרה לפני הזריקה.
3. השתמש קצה פיפטה microloader להוסיף 1-2 μl של פתרון ה-DNA פלסמיד ל פיפטה ההזרקה.
4. הרלאבטח את פיפטה נטען לתוך בעל מערכת הזרקה בלחץ פיפטה.
5. שישבור את גב פיפטה עמוסה מלקחיים בסדר עד פולסים הלחץ לייצר שחרור נפוח של פתרון ה-DNA אדום. לחלופין, טיפים ניתן לשבור בחזרה על ידי במהירות חודר מתחת למים, מקופל Kimwipe מעבדה.
   הערה: מאחר pipettes הזרקת חתומות בתחילה יש לשבור בחזרה באופן ידני, גודל קצה נפח הזרקה משתנה. Pipettes הזרקת אידיאלי צריך לדרוש 3-5 פולסים הזרקה לחלוטין למלא את החדר forebrain פיתוח של 24 עוברי hpf (100 פעימות ms זריקה ב 40 psi).
6. להזריק את פתרון ה-DNA פלסמיד לתוך החדרים של המוח המתפתח כאלה כי ה-DNA הוא נאלץ צמוד, ו intercalated לתוך האזור של המוח שנועד ליצור את הנורה חוש הריח. הנורה הריח נובע תאים בדופן הקדמי ביותר של החדר forebrain. לכן, על ידי הוספת פיפטה זריקה לתוך החדרים כך פיפטה מצביע לקראת סוף הקדמי של המוח המתפתח, הזרקה בלחץ כוחות ה-DNA לתוך ובצמוד הנורה הריח פוטנציאליים. להזריק DNA עד צבע אדום נראה בבירור בקצה הקדמי של החדר forebrain. בגלל ה-DNA מתחיל לפזר מיד, דילול DNA, חשוב להמשיך לשלב electroporation בהקדם האפשרי לאחר ההזרקה (למשל, בתוך 10 שניות).

4. Electroporation

1. Electroporation מתבצעת באמצעות בהקמה עצמית אלקטרודות עשויות פלטינה אלקטרודות subdermal גראס (עשב טכנולוגיה # E2). האלקטרודות מחוברות בדיקה כף יד, והמרחק הסופי בין אלקטרודות פלטינה צריך להיות 1 מ"מ (לפרטים על הבנייה לראות ^9). כיכר גל פולסים electroporation מיוצרים על ידי חיבור אלקטרודות SD-9 גראס ממריץ (עשב טכנולוגיה, דגם SD-9).
2. הגדר את ממריץ SD-9 כדי לייצר יחידה, 5 ms פולסים electroporation ב 70 וולט. מקם את האלקטרודות כזה האלקטרודה החיובית ממוקם סמוך לקצה הקדמי של העובר, ואילו האלקטרודה השלילית האחורי של ראש העובר. ידנית ליזום ~ 7-8 פולסים electroporation באמצעות מתג מצב יחיד של ממריץ את SD-9, להפריד כל הדופק ידי ~ 1 שניות. מתח מתאים ישתנה בהתאם לגיל העוברים ואת מקור מתח בשימוש. עוברים צעירים דורשים מתח נמוך כדי למנוע נזק לעובר, בעוד עוברי מבוגרים דורשים מתח גבוה כדי ליזום electroporation ^7.
3. אפשר העוברים להתאושש דקות לפחות אחרי 10 electroporation לפני לשחרר אותם מן agarose.
4. בעזרת מלקחיים בסדר, לשחרר את העוברים מן agarose על ידי התחקות בעדינות את קווי המתאר של עוברי תוך הימנעות ממגע ממשי עם העוברים עצמם.
5. לשחרר פעם אחת, להחזיר את העוברים למים ביצה (עם PTU במידת הצורך). שמור אותם על 28 מעלות צלזיוס עד שהם צילמו להיות ביטוי של GFP.

5. עוברים הרכבה הדמיה

1. העברת עוברים מהמים ביצה פלוס PTU למים ביצה פלוס 0.02% tricaine. אפשר מספר דקות ההרדמה ייכנסו לתוקף לפני שתמשיך לשלב גובר.
2. הכן פתרון 0.5% נמוך ההיתוך נקודות agarose בביצה מים בתוספת tricaine ידי במיקרוגל את הפתרון, ואז למקם את הפתרון לתוך 34-37 ° C חממה. לאחר טמפרטורה של הפתרון agarose יש equilibrated, מקום טיפה גדול (~ 300 μl) של הפתרון agarose למרכז בצלחת פטרי 35 מ"מ. מוסיפים העובר הרדים לירידה זו agarose.
3. בעזרת מלקחיים קנס (או מסתיים קנס של טיפים pipet לחתוך microloader), מקם את העוברים כזה כי הם זקוף, כך שניתן לדמיין תצוגה הגבי של המוח המתפתח עם מיקרוסקופ זקוף (טווחי הפוך ידרוש הגיאומטריה העובר שונה, וגם מנה שונה המאפשר הדמיה מלמטה; לראות ^12). לחזק את agarose על ידי הנחת צלחת על צלחת פטרי גדולה עם 2-3 מ"מ של קרח. Re אוריינטציה עם מלקחיים בסדר סביר להניח שיהיה צורך במהלך מיצוק על מנת להבטיח כי העובר לא מתהפך על צדו.
4. לאחר agarose יש הקרושה, להציף את צלחת עם ביצה מים בתוספת tricaine להבטיח כי הפתרון מכסה לחלוטין את הירידה הקרושה agarose.

6. נציג תוצאות:

למרות הביטוי GFP ניתן להבחין מוקדם ככל 6 שעות לאחר electroporation, כאן אנחנו מראים תמונות מעובר 4 ימים לאחר electroporation כזה כי המבנה neurite של התאים הממוקדים פיתחה מספיק. Et (zic4: Gal4TA4, כטב"מ: mCherry) ^hzm5 מהונדס קו משפר מלכודת מציגה ביטוי המכונן של mCherry (ו KalTA4) ב למוח האחורי, המוח הקטן, המוח הקדמי, ואת פקעת ההרחה בעוברים ב 5 ימים לאחר ההפריה (איור 1A ו-1C). עוברים כי יש לו ביטוי כטב"מ-GFP פלסמיד שולבו על ידי electroporation ממוקד (כמתואר לעיל), ביטוי של GFP להראות כי היא מוגבלת תאים של הנורה לפתח חוש הריח (איור 1B, 1D, 1E ו). התאים רק transgenically-לבטא את גורם שעתוק KalTA4 מסוגלים להפעיל ביטוי מתוך פלסמיד זה כטב"מ-GFP. התאגדות זו הפלסמיד לתוך הלא מהונדס עוברי אינו מוביל לגילוי כל ביטוי של GFP. לכן, הפעולה המשולבת של electroporation ממוקד של כטב"מים-GFP וביטוי מהונדס מקומי של הנהג KalTA4 שמוביל הביטוי הבלעדי של ה-GFP בתאים של הנורה חוש הריח מתפתח. GFP-לבטא בתאי להראות תחזיות axonal טיפוסי של תאים הנורה הריח צניפי (1B 1D איור ו) ^10. על מנת לחזות תחזיות האקסון, תמונות 1B הדמות 1D היה להיחשף ברמות גבוהות כאלה כי האזור של גופי התא היו גם חשוף יתר. רמה נמוכה יותר של חשיפה (איור 1E) מראה כי גופי התא להביע GFP הם נקודתיים אכן הנורה חוש הריח (איור להשוות 1C ו 1E,. קו אפור מסמן את הגבול של הנורה חוש הריח).

באיור 1. ממוקד ביטוי ב-GFP הנורה חוש הריח של העובר 5 דג הזברה DPF. Et (zic4: Gal4TA4, כטב"מ: mCherry) ^hzm5 מהונדס קו משפר מלכודת, מציגה ביטוי המכונן של mCherry במוח הקטן למוח האחורי, המוח הקדמי, ואת פקעת ההרחה (A ו-C, mCherry הקרינה באדום). ביטוי זה של mCherry מתווך על ידי מהונדס Gal4 ביטוי. עוברים כי כבר electroporated עם וקטור כטב"מ-GFP ביטוי ב hpf 28, להציג ביטוי של GFP ממוקד הנורה הריח בבית 5 ימים לאחר ההפריה (B, D ו-E, GFP הקרינה שמוצג ירוק. לעובר זהה ו ג). תמונה חשיפה נמוכה יותר בתחתית (ה) מראה כי הביטוי GFP מוגבל גופי התא של הנורה חוש הריח. הקו האפור מציין את הגבול של הנורה חוש הריח. השדה מואר (בסולם אפור), ירוק פלואורסצנטי (ירוק), אדום פלואורסצנטי (אדום) התמונות היו לוקחים עם מיקרוסקופ אולימפוס BX60 פלואורסצנטי.

דיון

הנה שתיארנו בשיטה electroporation vivo ב דג הזברה אשר מנצל מלכודת משפר Gal4 קו מהונדס למקד ביטוי transgene electroporated לאוכלוסייה ספציפית של תאים הנורה חוש הריח מתפתח. גישה זו משלבת את הרזולוציה הטמפורלית מצוינת ב electroporation vivo ⁷ עם הביטוי תאים מסוג מסוים בתיווך משפר קווי מלכודת מהונדס ^8. אמנם יש לנו כאן תיאר את המיקוד של הנורה חוש הריח, ב electroporation vivo ניתן להשתמש כדי למקד לאזורים אחרים של מערכת העצבים המתפתח ^2-7, ו משפר קווי מלכודת זמינים עם ביטוי ממוקד של Gal4 סוגים רבים שונים של תאים ספציפיים או רקמות ^{8, 11.} כמובן, זה טכניקה electroporation צריך להיות גם מתאים אחרים גישות גנטיות combinatioral כגון LexA או ט מערכות ^{13, 14, 15.} היתרון העיקרי של electroporation היא שיש לא צריך לעשות קווי מהונדס נוסף בהתחשב בעובדה מתאים Gal4 שורת זמין. זה חוסך שישה חודשים.

בשנת vivo electroporation מאפשר שילוב של oligonucleotides לתוך הנוירונים ומבשרי שלהם בכל מה השלב הספציפי של התפתחות מערכת העצבים מעניין ^7. זו החלטה הזמני יתרון במיוחד עבור ניתוח הפסד של פונקציה, כי זה יכול לעקוף בעיות עם מיקוד גנים שיש להם פונקציות חיוניות בשלבים התפתחותיים קודמים. השיטה שנתאר כאן יכול לשמש גם לשלב הפסד של פונקציה ריאגנטים כולל oligonucleotides RNAi או בונה morpholino אנטי תחושה oligonucleotides ^{4, 7.} פלסמיד מונחה ריאגנטים כגון דומיננטי שלילי הביטוי פלסמידים חלבון או סיכת קצר פלסמידים RNAi יכול גם להיות תחת בקרה של Gal4 כטב"מ, המאפשר סוג מסוים של התא ביטוי מדויק הראינו כאן ביטוי של GFP.

חומרים

ריאגנטים:

• Agarose, התכה נמוכה נקודות (Sigma, A9414)
• ערכת midi או maxi-הכנה פלסמיד (למשל Qiagen, # 12643]
• פנול אדום (Sigma, P3532)

ציוד:

• נימי זכוכית עם נימה: ID = 0.78 מ"מ; OD = 1.0 מ"מ (סאטר מכשירים, # BF100-78-10)
• גראס SD-9 ממריץ (עשב טכנולוגיה, דגם SD-9)
• פלטינה גראס אלקטרודות subdermal, המחט ישר (טכנולוגיה גראס, # E2)
• Micro-מטעין פיפטה טיפים (Eppendorf, # X22703R)
• פיפטה חולץ (למשל סאטר, דגם P-30)
• פיפטה חולץ (למשל סאטר, דגם P-30)