In Vivo Murine זילוח כבד: שיטה להחדיר לכבד המכרסם תמיסה דרך וריד הפורטל

תקציר

מקור: Cabral, F., et al. טיהור של הפטוציטים ותאי אנדותל סינוסואידים מזילוח כבד עכבר. J. Vis. Exp. (2018).

סרטון זה מתאר הליך של זילוח כבד עכברי דרך הווריד הפורטלי באמצעות תמיסת collagenase לפני בידוד תאי כבד.

פרוטוקול

כל הנהלים הנוגעים למודלים של בעלי חיים נבדקו על ידי הוועדה המוסדית המקומית לטיפול בבעלי חיים ועל ידי ועדת הבדיקה הווטרינרית JoVE.

1. הכנה

1. הכנת פתרונות ומדיה תרבותית
   1. הכינו את כל אמצעי התרבות והחיץ בהתאם לטבלת החומרים.
2. הכנת מכשירים
   1. הגדר אמבט מים (>10 ליטר) ב 42 ° C, משאבה פריסטלטית עם מהירות משתנה, מלחציים להחזקת צלוחיות. הכינו מספריים ומלקחיים מעוקלים (איור 1).
   2. על אמבט המים או בסמוך לו, הניחו תבנית אפייה (כ-38X26 ס"מ) עם פד קלקר (מתלה חרוטי בנפח 50 מ"ל), שמעליו כרית תחתונה סופגת חתוכה לחתיכה בגודל 20X20 ס"מ (איור 1).
   3. מניחים פיסת מסקינג טייפ (5-8 ס"מ) בקרבת מקום. מניחים בקרבת מקום חוט תפירה מפוליאסטר בקוטר 20 ס"מ, חתוך ומוכן לשימוש. השג קטטר פלסטיק עם מחט נשלפת (7 מ"מ x 19 מ"מ, איור 1).
3. הכנת כלי זכוכית
   1. באמצעות מלחציים, מניחים ולשתק בקבוק 1 L באמבט המים המכיל 200 מ"ל של 1x PBS עם פקק שיש לו שתי פיפטות 1 מ"ל נכנס לתמיסה. פקק הגומי מחורץ כדי לאפשר מחזור של נוזל במעגל סגור.
   2. בעזרת מהדק נוסף, מניחים בקבוק 125 מ"ל המכיל 45 מ"ל של Buffer 2 יחד עם פקק בעל שתי פיפטות 1 מ"ל, שאחת מהן נמצאת בנוזל בסמוך לתחתית הבקבוק והשנייה נשארת מעל הנוזל ומזרימה חמצן לצלוחית.
      הערה: לכל פיפטה בפקקים יהיה מתאם ניתוק מהיר המחובר לקצה להחלפה קלה של הצינור. חמצן יזרום בעדינות לשתי הצלוחיות דרך פיפטה בפקק שאינו שקוע בנוזל.
   3. מניחים בצד שתי מנות גיבוש סטריליות.

2. נוהל בעלי חיים

1. חממו את תמיסות PBS ו-Buffer 2 לטמפרטורה של 42°C באמבט המים והזרימו PBS למשך 20 מ"ל/דקה לפחות בצינורות במעגל סגור כדי לשמור על חום קווי הנוזלים. לטבול כל צינורות עודפים באמבט המים להישאר קרוב ככל האפשר ל 42 ° C. לנקז את הקצה הגברי של הצינור לתוך בקבוק 1 L המכיל PBS.
2. מניחים כדור צמר גפן על התחתונים הסופגים ומוסיפים כ-2 מ"ל של 30% איזופלורן (המורכב מפוליאתילן גליקול 200 שמקטין את קצב האידוי של איזופלורן) על כדור הצמר גפן באמצעות פיפטת העברה.
3. הרימו את העכבר בזנב, הניחו אותו באחד הכלים המגבשים, ואז הפכו במהירות את המנה על כדור הצמר גפן, כך שלעכבר יהיה מקום קטן לשאוף בו את ההרדמה. שימו לב לקצב הנשימה של העכבר וודאו שהעכבר נמצא ביעילות תחת הרדמה.
   הערה: קצב הנשימה צריך להיות איטי ועמוק יותר, הזנב רפוי, והכפות אינן מגיבות לבדיקת הצביטה בהרדמה; עיין בהנחיות IACUC לקבלת פרטים נוספים.
4. בזמן שהעכבר נמצא תחת הרדמה (זה לוקח 1-2 דקות), הכינו את החבית של מזרק 10 מ"ל על ידי שליפת הבוכנה והכנסת כדור צמר גפן קטן. מוסיפים 1-2 מ"ל של 30% איזופלורן עם פיפטת העברה לכדור הצמר גפן בתוך החבית ומניחים את הקנה פתוח על שולחן בזמן שהם ממתינים שהעכבר יאבד את הכרתו.
5. הסירו במהירות את המנה המתגבשת, הפכו את העכבר על גבו והניחו את קנה המזרק על אפו. בדוק שוב את קצב הנשימה, צביטת הבוהן והזנב הרפוי. כל תגובה לצביטה בבוהן ולזנב רפוי מצביעה על כך שהעכבר אינו נמצא תחת הרדמה מלאה. שמור את קנה המזרק מעל החוטם כדי לשמור על חוסר הכרה.
6. הניחו את האגודל דרך כפות העכבר, כשהגפיים מושטות במצב שכיבה. יש להרטיב את כלוב הצלעות והבטן עם 70% איזופרופנול או אתנול.
7. עם המלקחיים הישרים ביד אחת, הרימו את העור ליד בסיס הבטן. עם מספריים ביד השנייה, לחתוך את העור אוהל פריטונאום. החתך צריך להיות אופקי או לרוחב בסיס עור האוהל. הקפד לחתוך דרך כל שכבות העור והצפק על מנת לקבל גישה למעיים. חותכים לרוחב סביב הבטן עד לכלוב הצלעות משני הצדדים מבלי לנקב אף אחד מהאיברים.
8. חתכו את דש העור על ידי חיתוך לאורך כלוב הצלעות התחתונות. הזיזו את המעיים ימינה עם גב המלקחיים כדי לחשוף את הווריד הפורטלי.
   הערה: דימום מן החיה צריך להיות מינימלי; בעל החיים עדיין צריך להיות נושם תחת הרדמה עמוקה.
9. הניחו את המלקחיים הסגורים והמעוקלים מתחת לווריד הפורטלי שבין הכבד לווריד הלבלב העליון (חץ איור 2).
10. פתח את המלקחיים מתחת לווריד השער. אחזו בחוט ומשכו אותו בזהירות כך שהוא יהיה ממורכז מתחת לווריד השער. קשרו קשר ידני סביב וריד השער מבלי לכווץ אותו.
11. הניחו את המלקחיים המעוקלים מתחת לווריד השער ומשכו אותם בעדינות לכיוון זנב העכבר כדי ליישר את הווריד (איור 3A).
12. עם הצנתר ביד השנייה, הניחו את שיפוע המחט עם הפנים כלפי מעלה ובמקביל לחלק התחתון של וריד השער ליד המלקחיים (איור 3B).
13. נקבו בעדינות את הווריד עם המחט (איור 3C). ודא את השיפוע של המחט הוא לומן של הווריד. משכו את המחט הטעונה בקפיץ והמשיכו לדחוף את צנתר הפולימר דרך הווריד עד שהשיפוע קרוב לאזור הוורידי המסועף. זה בתוך הכבד. אם הצנתר ממוקם כראוי, זרימה חוזרת של דם יהיה גלוי. (איור 3D).
14. הדקו את הקשר העילי ומשכו אותו מטה על הצנתר כדי לסייע בייצובו. הנמיכו מיד את קצב המשאבה מ-20 מ"ל/דקה ל-4 מ"ל/דקה וחתכו כלי דם מרכזי נוסף לצורך ניקוז. חתכו את אבי העורקים הבטני לקבלת תוצאות מיטביות.
15. הניחו את הקצה הזכרי של הצינורית בקצה הנקבי של הצנתר (איור 4A). ודא שאין בועות אוויר בקו. היזהר כי הצנתר אינו נדחף לתוך הכבד או מתוך הווריד. מיקום החוט אינו חיוני, אם כי הוא מסייע במניעת זרימה חוזרת החוצה מהווריד ועוזר לשמור על הצנתר במיקום הנכון (איור 4B, C).
16. השתמש מסקינג טייפ כדי לשתק את הצינור על הכרית התחתונה. השתמשו במלקחיים הישרות כדי לסחוט את כלי הדם של השפכים כדי לנפח את הכבד כמה פעמים כדי לוודא שכל הדם התנקז החוצה (איור 4D).
    הערה: סרט מעבדה סטנדרטי לא יכול לעבוד; עם זאת, מסקינג טייפ יישאר דבוק לכרית התחתונה, גם בתנאים רטובים.

3. זילוח הכבד

1. בזמן שהכבד שוטף עם PBS, מדדו כ-24 מ"ג של Collagenase Type IV והניחו אותו בבקבוק המכיל 45 מ"ל של Buffer 2 באמבט המים. הקפידו לערבל את הנוזל בבקבוק כך שהקולגנאז יתמוסס במלואו והניחו את הבקבוק בחזרה במהדק, כך שהנוזל המכיל חלק מהבקבוק יהיה שקוע במלואו במים.
2. שימו לב לשינוי בצבע הכבד כשהוא סמוק עם PBS. שנה את צינור הזרימה מבקבוק 1 ליטר לצלוחית 125 מ"ל. אין לאפשר לבועות אוויר לזרום לתוך הכבד.
3. ברגע שמאגר הזילוח מגיע לכבד, סחטו לזמן קצר את כלי הדם של השפכים כדי לבנות לחץ מסוים בתוך כלי הדם ולאפשר לנוזל זה למלא את כל אונות הכבד. הקפידו לא לנתק את הניקוז זמן רב מדי, שכן הדבר עלול לפוצץ את רקמת החיבור הדקה המקיפה את הכבד (הקפסולה של גליסון) ולהרוס את הזלוף או זרימת הנוזלים בתוך מצע הנימים של הכבד.
4. אפשר Buffer 2 עם collagenase לחלחל דרך הכבד עד שכל 45 מ"ל זרמו דרך הרקמה.
   הערה: אם היא מצליחה, יש להפריד את הקפסולה של גליסון מהפרנכימה או מרקמת הכבד והכבד עצמו אמור להיראות אמורפי.
5. מוסיפים כ-10 מ"ל של Buffer 1 לצלחת המתגבשת השנייה ומניחים אותה ליד העכבר.
6. הוציאו את הצנתר וכבו את המשאבה.
7. בעזרת המלקחיים והמספריים הישרים חותכים את הכבד מהעכבר. אם עיכול הקולגנאז היה יעיל מאוד, ייתכן שיהיה צורך בכפית נקייה וסטרילית בהישג יד כדי לגרוף את הכבד מהעכבר ולמקם אותו בחיץ 1.

תוצאות

איור 1: ייצוג סכמטי של חבילת הזלוף. הצלוחיות מוחזקות במקום על ידי מלחציים (לא מוצג); הצינור המכיל נוזל מוחלף מן בקבוק 1L לבקבוק 125 מ"ל במהלך ההליך מיוצג על ידי קו מקווקו אדום. שימו לב, שהזנת החמצן אינה מבעבעת ישירות לתוך התמיסות בצלוחיות. כמו כן, יש לחרוץ את הפקקים כדי לאפשר זרימת נוזל במעגל סגור עם הצינור המוכנס לחריץ. זה קריטי במהלך חימום הצינור ולפליטת כל האוויר בתוך הצינור. דימום...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
1 ליטר בקבוק Erlenmeyer	פישר סיינטיפיק	S63274
250 מ"ל בקבוק Erlenmeyer	פישר סיינטיפיק	S63271
צינורות סיליקון	קול-פרמר	96400-14	צינור זה עובר מהצלוחיות דרך המשאבה למחבר T ולאחר מכן למזרק 1.0 מ"ל המחובר לקטטר.
צינורות טייגון	פישר סיינטיפיק	₪903	משמש כמתאם בין 96400-14 ופיפטות ומחבר T. זה עשוי לשמש גם עבור צינורות חמצן.
מחברי T	קול-פרמר	EW-06294-82
ניתוקים מהירים	פישר סיינטיפיק	6150-0010
קמצוץ מלחציים	פישר סיינטיפיק	6165-0002
משאבת מהירות משתנה Masterflex L/S; דגם 7553-70	קול-פרמר	EW-07559-00	משאבה פריפלסטית במהירות משתנה
ראש משאבה; דגם 7014-20	קול-פרמר	EW-07014-20
זכוכית בוגרת 1.0 מ"ל פיפטות	פישר סיינטיפיק	13-678
מספריים מעוקלים שאינם משוננים	כלים מדעיים משובחים	14069-12
מלקחיים Dumont	כלים מדעיים משובחים	11252-20
מלקחיים מעוקלים	כלים מדעיים משובחים	13009-12
מזרק 10 מ"ל	פישר סיינטיפיק	03-377-23	יהיה צורך רק בחבית מזרק
כף מעוקרת	חנות לציוד לבית
כדור(ים) צמר גפן	חנות לציוד לבית
חוט תפירה פוליאסטר	חנות לציוד לבית
סרט מיסוך	חנות לציוד לבית
נעיצות אגודל	חנות לציוד לבית
פד קלקר	50 מ"ל מתלה חרוטי
תבנית עוגייה/אפייה	חנות לציוד לבית
תחתונים סופגים	פישר סיינטיפיק	14-206-64
אמבט מים 19 ליטר	פישר סיינטיפיק	TSCOL19
BD Insyte Autogaurd מסוכך IV קטטר 24 guage	בקטון דיקינסון	381412	קטטר פלסטיק עם מחט נשלפת
גיבוש כלים 100x50	VWR	89000-290
צלחות פטרי פוליסטירן	סיגמא אולדריץ'	P5481-500EA
50 מ"ל צינורות חרוטיים	פישר סיינטיפיק	12-565-270
פיפטות מדורגות (5 מ"ל)	פישר סיינטיפיק	170355
פיפטות מדורגות (25 מ"ל)	פישר סיינטיפיק	170357
EasyStrainer 100 מיקרומטר	גריינר ביו-וואן	542000	מסנן 100 מיקרומטר
EasyStrainer 40 מיקרומטר	גריינר ביו-וואן	542040	מסנן 40 מיקרומטר
ריאגנטים
שם	תרכובת	גרם (גר'/ליטר)	מילימולר (mM)
חיץ 1; pH 7.4	NaCl	8.3	142
	KCl	0.5	6.7
	HEPES	2.4	10
	BSA	15	0.226
חיץ 2; pH 7.4	NaCl	3.9	66.74
	KCl	0.5	6.71
	CaCl2	0.7	6.31
	HEPES	24	100
	BSA	15	0.226
	פנול אדום	0.01	0.03
PBS; pH 7.4	NaCl	8	137
KCl	0.2	2.7
Na2HPO4-7H2O	1.15	4.3
KH2PO4	0.2	1.4
ריאגנטים אחרים
שם	חברה	מספר קטלוגי	הערות
קולגנאז סוג IV	סיגמא אולדריץ'	C5138
איזופלורן	אבקאם	ab144581