בדיקת פגוציטוזה מיקרוגליאלית: בדיקת מבחנה לביסוס מודל פגוציטוזה מיקרוגליאלית עבור תאי נוירובלסטומה באמצעות מקרופאגים iPSC

תקציר

מקור: Hall-Roberts, H. et al. בדיקת הדמיה כמותית במבחנה לפאגוציטוזה של תאי נוירובלסטומה מתים על ידי iPSC-מקרופאגים. J. Vis. Exp. (2021)

בסרטון זה, אנו מבצעים את בדיקת פגוציטוזה מיקרוגליאלית עבור נוירובלסטומה באמצעות תאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים. הבדיקה מסייעת להעריך את הפגיעה בתפקוד המיקרוגליאה במחלות נוירודגנרטיביות.

פרוטוקול

1. תיוג SH-SY5Ys מת בצבע פלואורסצנטי אדום רגיש ל-pH

1. התחל עם תאי SH-SY5Y קבועים המרחפים במדיה חוצצת HEPES ללא פנול. ספור את התאים והסר את המספר הכולל של התאים הדרושים לתוך צינור 2 מ"ל נמוך חלבון קושר. עבור כל 1 מיליון SH-SY5Ys, לפצות את הנפח הכולל בצינור 2 מ"ל ל 300-500 μL עם פנול אדום HEPES-buffered מדיה. חממו את הצינור לזמן קצר באמבט מים של 37 מעלות צלזיוס.
2. הרכיבו מחדש את הצבע הפלואורסצנטי האדום הרגיש ל-pH STP אסטר (ראו טבלת חומרים) והוסיפו 12.5 מיקרוגרם צבע למיליון SH-SY5Y לצינור התאים החם של 2 מ"ל. מערבבים בעדינות על ידי פיפט. יש לדגור על הצינור בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות, מוגן מפני אור.
   הערה: מיני STP ester של הצבע הרגיש ל- pH מגיבים עם אמינים ראשוניים, ולכן אסור שמאגר הסימון יכיל אמינים חופשיים. בשל מסיסות מוגבלת פוטנציאלית במאגרים מימיים, יש להוסיף את הצבע המומס ב-DMSO רק כדי לחמם את החיץ המימי, לערבב מיד ולבדוק סימנים של משקע (חלקיקים כהים תחת מיקרוסקופ אור).
3. הוסף 1 מ"ל HBSS וצנטריפוגה ב 1200 x גרם במשך 7 דקות ב 4 ° C. להשליך את supernatant ולשטוף עם 2 מ"ל HBSS. חזור על הצנטריפוגה.
4. השליכו את הסופרנאטנט והשהו מחדש את התאים במצעי מקרופאגים נטולי אדום פנול (ראו טבלת חומרים) לריכוז של 200,000–1.2 מיליון תאים/מ"ל כך ש-50 מיקרוליטר הם 10,000–60,000 תאים (כלומר, פי 0.5–פי 3 יותר SH-SY5Ys מאשר מקרופאגים iPSC).
   הערה: פנול אדום במדיה מגביר פלואורסצנטיות רקע, ולכן, יש להשתמש במדיה נטולת פנול אדום אם יש לבצע הדמיה של תאים חיים. אחסון SH-SY5Ys המוכתם למשך יותר מכמה שעות אינו מומלץ מכיוון שזה לא הוערך. שמור SH-SY5Ys מוכתם על קרח והגן מפני אור.

2. צביעה של iPSC-מקרופאגים

1. בארון בטיחות ביולוגי, הכינו תמיסה במצע מקרופאגים של צבע אדום-פלואורסצנטי עמוק, חודר לתאים, סוצינימידיל אסטר-תגובתי (ראו טבלת חומרים). הוסף Hoechst 33342 (ראה טבלת חומרים). חממו את פתרון העבודה ל -37 מעלות צלזיוס באמבט מים.
2. שאפו את מדיום המקרופאגים iPSC בעדינות על ידי החדרת הסופרנאטנט התא עם פיפטה רב ערוצית למאגר סטרילי. הוסף 70 μL/well של תמיסת הצבע שהוכנה בשלב 2.1 למקרופאגים iPSC, באמצעות פיפטה רב ערוצית. יש לדגור במשך שעה אחת בטמפרטורה של 37°C ו-5% CO₂.
3. הכינו טיפולים ניסיוניים במדיית מקרופאגים נטולי אדום פנול. כלול 10 מיקרומטר cytochalasin D כטיפול בקרה שלילית. לאחר הדגירה, שאפו את מדיום iPSC-מקרופאגים בעדינות רבה עם פיפטה רב ערוצית והוסיפו 100 μL/well של תמיסת מלח חוצצת של האנק (HBSS), לשטיפה. הסר מיד HBSS על ידי פיפטינג עדין, ולאחר מכן הוסף 100 μL של תרכובות ± מדיה. יש לדגור במשך 10 דקות-שעה בטמפרטורה של 37°C ו-5% CO₂.
   הערה: Cytochalasin D הוא מעכב אקטין רב עוצמה וחוסם phagocytosis. עבור כל טיפול ניסיוני הדורש דגירה ארוכה יותר, למשל, 24-72 שעות, בצע את הטיפול הניסיוני לפני שלב 2.1, באמצעות 100 μL / well של טיפול במצע מקרופאגים מלא. בצע את שלבים 2.1-2.3 בהתאם לפרוטוקול, כך שצביעת התאים מבוצעת ולאחר מכן הטיפול מיושם מחדש במדיה מקרופאגים ללא אדום פנול למשך שארית בדיקת הפאגוציטוזה.

3. הדמיה פגוציטוזה

1. הדמיה בתוכן גבוה של תאים קבועים
   1. השתמש פיפטה רב ערוצית להוסיף 50 μL של SH-SY5Ys מסומן לכל באר, להוסיף לצד של כל באר בקצה הנוזל. יש לדגור בטמפרטורה של 37°C ו-5%_CO2 למשך 3-5 שעות.
   2. לאחר הדגירה של פאגוציטוזיס, שואפים בעדינות סופרנאטנטים של תאים על ידי פיפטה עם פיפטה רב ערוצית, ומשליכים. יש לשטוף פעם אחת עם 100 מיקרוליטר PBS.
   3. מקבעים את הצלחת על ידי תוספת של 100 μL של 2% paraformaldehyde ולדגור במשך 15 דקות בטמפרטורת החדר.
   4. לשאוף בארות ולהוסיף 100 μL של PBS. מכסים עם חותם צלחת ונייר כסף; יש לאחסן ב-4°C עד לצורך.
      הערה: ניתן לאחסן כך את לוחית הבדיקה למשך שבוע לפחות ללא ירידה משמעותית באות; אחסון ארוך יותר לא נבדק.
   5. הפעל את מיקרוסקופ ההדמיה בעל התוכן הגבוה (ראה רשימת חומרים) ופתח את תוכנת לכידת התמונות. טען את צלחת הבדיקה למיקרוסקופ על ידי לחיצה על טען סמל בחלק העליון של המסך.
   6. בחר בכרטיסיה הגדרה. בתפריטים נפתחים של התיבה השמאלית העליונה: בחר את סוג הצלחת המתאים, בחר באפשרות המיקוד האוטומטי Two Peak (ברירת מחדל), בחר את המטרה 40x Water, NA1.1, בחר מצב Confocal ובחר binning of 1.
   7. יש לשטוף את המטרה 40x מים לפני השימוש דרך תפריט ההגדרות.
   8. בתיבה בחירת ערוץ, השתמש בסמל + כדי להוסיף את הערוצים DAPI, Alexa 647 ו- Alexa 568. הגדר אותם למדידה במישור יחיד של 1 מיקרומטר. מטב את הגדרות הזמן וההספק ליעילות הצביעה של צלחת הבדיקה.
      הערה: כקו מנחה, הגדר את DAPI לחשיפה של 200 אלפיות השנייה והספק של 100%, את Alexa 647 בחשיפה של 1500 אלפיות השנייה ואת הספק של 100%, ואת Alexa 568 בחשיפה של 100 אלפיות השנייה ובהספק של 40%.
   9. ודא שהערוצים אינם נמדדים בו זמנית על ידי לחיצה על רצף ערוצים כדי להפריד בין הערוצים.
   10. תחת ניווט | הגדר פריסה, בחר בארות מדידה ובחר 9-12 שדות לכל באר.
   11. במהלך ההגדרה, לחצו על שדה מייצג במפת הלוחות, ובדקו כל ערוץ מדידה בתורו, כדי לוודא שהצביעה קיימת ושהתמונות ממוקדות, על ידי התאמת הסטת הערוץ.
   12. כדי להעלות נתונים לשרת לצורך ניתוח מרחוק, לחץ על התיבה משימות מקוונות ועל שם המסך הרלוונטי; הדבר יאפשר העלאה אוטומטית של הנתונים לשרת לאחר ההדמיה.
   13. שמור את פרוטוקול הבדיקה על ידי לחיצה על להציל לחצן.
   14. לחץ על הכרטיסייה הפעל ניסוי בחלק העליון ותן שם ללוח הניסוי, ולאחר מכן לחץ על התחל.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
15 מ"ל צינור צנטריפוגה חרוטי	בז	352096	עבור צנטריפוגה של תאים
2-20 μL, 20-200 μL, 100-1000 μL מיקרופיפטות חד-ערוציות
4% פרפורמאלדהיד ב-PBS	אלפא עזר	J61899	לקיבוע תאים
צלחת 6 בארות, תרבית רקמות מטופלת
צלחת 24 בארות AggreWell-800	טכנולוגיות STEMCELL	34815	צלחת מיקרווול בעלת היצמדות נמוכה של 24 בארות להיווצרות גופים עובריים
מונה תאים אוטומטי
צנטריפוגת ספסל
מיקרוצנטריפוגה Benchtop
CellCarrier-96 Ultra Microplates, טיפול בתרבית רקמות, שחור, 96-well עם מכסה	פרקין אלמר	6055302	מיקרו-צלחת מטופלת בתרבית רקמה 96 בארות (TC) עם דפנות באר שחורות ותחתית שקופה אופטית, לבדיקת פאגוציטוזה
תוכנת CellProfiler			תוכנת קוד פתוח לניתוח תמונות פאגוציטוזה המתקבלות על ידי מיקרוסקופ בהילוך מהיר של תאים חיים. הורד בחינם מאתר האינטרנט (http://cellprofiler.org/), פרוטוקול זה השתמש בגרסה 2.2.0.
CellTracker צבע אדום עמוק	תרמו פישר	C34565	צבע אדום-פלואורסצנטי עמוק, חודר לתאים, סוצינימידיל אסטר-תגובתי להכתמת ציטופלסמה של iPS-מקרופאגים. ממיסים את צבע CellTracker אדום עמוק ב-DMSO ל-2 מילימטר (1.4 מ"ג/מ"ל). יש להשתמש ב-1 מיקרומטר, על ידי דילול מלאי DMSO עם מדיית מקרופאגים.
ארון בטיחות למינרי לזרימת אוויר Class 2
בקבוק גז CO2			אביזר עבור EVOS FL Auto
אינקובטור CO2, מוגדר ל-37°C ו-5% CO2
ציטוכלסין D	קיימן	11330	טיפול בקרה שלילית עבור בדיקת phagocytosis. יש להרכיב מחדש ב-DMSO ל-10 מילימטר ולאחסן את ה-aliquots בטמפרטורה של -20°C, תוך הימנעות ממחזורי הקפאה-הפשרה נוספים. יש להשתמש בריכוז סופי 10 מיקרומטר.
DMEM/F12	גיבקו	11320074	רכיב של מדיה SH-SY5Y
DMSO	סיגמא	D8418	ממס לצבעי CellTracker ו-pHrodo
סרום בקר עוברי	סיגמא	F4135	רכיב של מדיה SH-SY5Y
Geltrex ללא LDEV, מאושר hESC, גורם גדילה מופחת ממברנת מרתף	Invitrogen	A1413302	מטריצת קרום מרתף בעלת אישור hESC עבור תרבית iPSC
תוסף GlutaMAX	גיבקו	35050-038	רכיב במדיה של היצרן והמקרופאגים
HBSS	לונזה	להיות 10-547F	תמיסת המלח המאוזנת של האנק לשלבי שטיפה
IL-3 רקומביננטי אנושי	גיבקו	PHC0033	רכיב במדיה של היצרן והמקרופאגים
פתרון הדמיה של תאים חיים	תרמו פישר	A14291DJ	חומר אחסון HEPES-buffered ללא פנול אדום לתיוג SH-SY5Ys מת
צינוריות דלות חלבון קושרות 2 מ"ל	אפנדורף	30108.132	להכתמת SH-SY5Ys
M-CSF	תרמו פישר	PHC9501	רכיב במדיה של היצרן והמקרופאגים
mTeSR1 בינוני	טכנולוגיות STEMCELL	85850	מדיה iPSC
פיפטה רב ערוצית 20-200 uL			לטיפול נוזלי בצלחת 96 בארות
מגיב NucBlue Live ReadyProbes	תרמו פישר	₪1000	נוסחת Hoechst 33342 בבקבוק טפטפת להכתמת גרעינים של iPS-מקרופאגים, יש להשתמש ב-0.5 טיפות/מ"ל במצע מקרופאגים.
מערכת הקרנת תוכן גבוה של Opera Phenix	פרקין אלמר	HH14000000	מיקרוסקופ הדמיה בעל תוכן גבוה, בשימוש עם תוכנת הרמוניה גרסה 4.9.
פניצילין-סטרפטומיצין	גיבקו	15140-122	רכיב במדיית מפעל, מקרופאגים ו-SH-SY5Y
pHrodo iFL אדום STP-Ester	תרמו פישר	P36011	צבע פלואורסצנטי אדום רגיש ל-pH לסימון SH-SY5Ys מת. הרכיבו מחדש אבקת pHrodo iFL Red STP Ester ב-DMSO לריכוז של 5 מ"ג/מ"ל. עבור כל מיליון SH-SY5Ys, יש להוסיף 2.5 μL (12.5 מיקרוגרם) של מלאי pHrodo iFL Red STP Ester לתאים שחוממו מראש המרחפים בתמיסת הדמיה של תאים חיים.
מילוי פיפטה סרולוגי
צלוחיות T175, טיפול בתרבית רקמות			כלי להבחנות של מבשרי iPSC-מקרופאגים, המכונים "מפעלים"
בקבוק T75			כלי לתרבות SH-SY5Y
אוטמי פלטות שקופים	גריינר ביו-וואן	676001	לאחסון והובלה של לוחיות בדיקה
אמבט מים, כוון ל-37°C
X-VIVO 15 בינוני עם L-גלוטמין, גנטמיצין ופנול אדום	לונזה	BE04-418F	רכיב של מדיה מפעל ומקרופאגים
X-VIVO 15 בינוני עם L-גלוטמין; ללא גנטמיצין או פנול אדום	לונזה	04-744Q	פנול אדום ללא מקרופאגים מדיה, לשימוש phagocytosis ללא תוספים או גורמי גדילה