בידוד גרעינים מרקמות גליומה טריות קפואות: שיטה להשגת גרעינים שלמים מדגימות גידולי גליומה

תקציר

מקור: Narayanan, A. et al. בידוד גרעינים מגידולי מוח קפואים טריים עבור RNA-seq ו-ATAC-seq בעלי גרעין יחיד. J. Vis. Exp. (2020)

סרטון זה מתאר את הפרוטוקול לבידוד גרעינים בודדים מרקמת גליומה טרייה קפואה. הגרעינים הבודדים יכולים לשמש כדגימות לטכניקות ריצוף כגון ריצוף RNA של גרעינים בודדים (snRNA) ובדיקת גרעינים בודדים לריצוף כרומטין נגיש טרנספוזאז (snATAC) כדי לקבל תובנות עמוקות יותר לגבי הטרוגניות בין ותוך גידולים שנצפתה בגליומה של רקמות העצבים המרכזיות.

פרוטוקול

1. דיסקציה ודיסוציאציה של רקמות

1. מעבירים דגימת רקמה קפואה טרייה (10-60 מ"ג) לצלחת פטרי מצוננת מראש. טחנו/קוצצים רקמה קפואה טרייה בעזרת סכין גילוח לחתיכות קטנות על קרח.
2. הוסף 500 μL של חיץ גרעינים מצונן ליזה לצינור 1.5 מ"ל מקורר מראש. מניחים את חתיכות הרקמה בצינור 1.5 מ"ל המכיל את חיץ הגרעינים ליזה ומעבירים ל- Douncer (Table of Materials).
   הערה: ישנם שני מזיקים הומוגנייזרים מסוג Dounce: מזיק "רופף" או "A" להפחתת דגימה ראשונית ומזיק "הדוק" או "B" להומוגניזציה מלאה של הדגימה.
3. מקפיצים את חתיכות הרקמה עם המזיק ה"רופף" במשך כ-20 פעימות, עד לחיכוך מופחת. אם קיימת לכלוך, הדגימה עשויה להיות מנוקה מראש על ידי סינון עם מסננת 100 מ"מ.
4. להקפיץ עם pestle "הדוק" במשך 20 שבץ כדי להשיג הומוגניזציה מלאה של רקמות.
5. מעבירים את ההומוגנאט (כ-500 מיקרוליטר) לצינור 2 מ"ל מקורר מראש. מוסיפים 1 מ"ל של חיץ ליזיס צונן. מערבבים בעדינות ודוגרים על קרח במשך 5 דקות. מערבבים בעדינות עם קצה פיפטה רחב וחוזרים על הפעולה 1-2 פעמים במהלך הדגירה.
6. מסננים את כל ההומוגנט באמצעות רשת מסננת של 30 מיקרומטר, אוספים לתוך צינור פלקון 15 מ"ל ומעבירים בחזרה לצינור 2 מ"ל חדש מקורר מראש. מסננת אחת מספיקה בדרך כלל לכל ההומוגנאט.
7. בדוק תחת מיקרוסקופ אור כדי לוודא את הסרת פסולת גדולה ואת שלמות קרום הגרעין. גרעינים צריכים להיות עגולים ואין לעוות את קרום הגרעין. אם קיימת פסולת, ניתן לסנן מחדש גרעינים.
8. צנטריפוגה את הגרעינים ב 500 x גרם במשך 5 דקות ב 4 ° C על צנטריפוגה ספסל. הסר את supernatant, משאיר מאחור ~ 50 μL עם גלולה המכילה את הגרעינים. משעים בעדינות את הגלולה ב-1 מ"ל נוספים של חיץ גרעיני ליזה ודגרים במשך 5 דקות על קרח.
9. צנטריפוגה של הגרעינים בטמפרטורה של 500 x גרם למשך 5 דקות ב-4°C. הסר את הסופרנאטנט מבלי להפריע לכדורית, הוסף 500 מ"ל של 1x חוצץ הומוגניזציה (HB) (טבלה 1) ודגור במשך 5 דקות ללא השהיה מחדש. לאחר מכן, להשעות מחדש את הגרעינים עוד 1.0 מ"ל של 1x HB.
10. צנטריפוגה את הגרעינים ב 500 x גרם במשך 5 דקות ב 4 ° C. להסיר את supernatant בעדינות resuspend את הגרעינים ב 200 μL של 1x HB לתוך צינור חדש 2.0 מ"ל.

    טבלה 1: הכנת 1x תמיסה לא יציבה של חיץ הומוגניזציה (2 מ"ל לדגימה)

    1x Homogenization Buffer Unstable Solution (2 מ"ל לדגימה)
    מגיב	קונק סופי.	Vol לכל מדגם (μL)
    6x חוצץ הומוגניזציה לא יציב	1x	333.33
    1 מטר סוכרוז	320 מ"מ	640.00
    50 מ"מ EDTA	0.1 מ"מ	4.00
    10% NP40	0.1%	20.00
    ח2O		1006.27

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
2-מרקפטואתנול	סיגמא	M6250
CaCl2	סיגמא	21115-100 מ"ל
EDTA (מטר 0.5	תרמו סיינטיפיק	₪250
בז 15 מ"ל צינורות צנטריפוגות חרוטיות	פישר סיינטיפיק	352096
מסננות MACS SmartStrainers (100 מיקרומטר)	Miltenyi ביוטק	130-098-463
מ"ג(Ac)2	סיגמא	63052-100 מ"ל
NP-40	אבקאם	ab142227
ערכת בידוד גרעינים: Nuclei EZ Prep	סיגמא	NUC101-1KT
צינורות נעילה בטוחים 1.5 מ"ל	אפנדורף	30120086
צינורות נעילה בטוחים 2.0 מ"ל	אפנדורף	30120094
סוכרוז	סיגמא	S0389
קצוות פיפטה רחבים (1000 μL)	תמו פישר סיינטיפיק	2079GPK

)